Name: examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.

1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
<ol><li>Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung. Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li><li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro.">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li><li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li><li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia.">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li><li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+(GRASP)+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems.">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li><li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation.">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li><li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+olfactory+processing+in+Drosophila:+mechanisms+and+principles.">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain.">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain.">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li><li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses.">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li><li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+in+Drosophila:+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior,+neuronal+signaling,+and+physiology+in+the+fly.">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li><li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laserspritzer:+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions.">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li><li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice.">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta.">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li><li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap.">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li></ol>

Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen ...

Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit zwischen den einzelnen Action potentials in den präsynaptischen Zellen und dem Beginn der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in der zweiten Nervenzelle messen. Monosynaptische Verbindungen sollten kurze Wartezeiten von ein paar Millisekunden und geringe Variabilität3haben. Dieser Ansatz kann in Wirbellosen Neuronen kompliziert sein, denn Synapsen in ihre Dendriten weit von der somatische Aufnahme Website, was zu Verzögerungen in der Erkennung durch lange electrotonic Abstände zwischen postsynaptischen maßgearbeitet und der Aufnahme auftreten können Elektrode. Solche Verzögerungen können Unklarheiten bezüglich Poly-im Vergleich zu monosynaptischen Beiträge vorstellen. Darüber hinaus kleine synaptische Ereignisse kann vor Erreichen der somatischen Aufnahmen Website zerfallen, und fahren stärker präsynaptischen Aktivität wird voraussichtlich polysynaptische Veranstaltungen zu rekrutieren.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um für monosynaptischen Verbindungen bei Wirbellosen zu testen. Ein Ansatz setzt hohe zweiwertigen kationen (Hi-Di) mit überschüssigem Mg++ und Ca++. Diese Lösung blockiert polysynaptische Verbindungen durch reduzierende Release Wahrscheinlichkeit und zunehmende Aktionspotential Schwelle, Erkennung von monosynaptischen Eingang4,5zu bevorzugen. Bestimmung der genauen Verhältnis von Mg++ bis ca.++ erforderlich, jedoch ist nicht trivial und polysynaptische Beiträge können selbst bescheidene Stimulation6anhalten. Ein alternativer Ansatz namens GFP Rekonstitution über Synaptic Partner (GRASP) nutzt die Nähe zwischen Prä- und postsynaptischen Membranen gefunden an den Synapsen, einem monosynaptischen Verbindung 7abzuleiten. Hier eine Komponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) äußert sich in einer Nervenzelle und der ergänzenden Fragment des Moleküls drückt sich in einem vermeintlichen postsynaptischen Partner. Das Vorhandensein der Fluoreszenz zeigt, dass die zwei Neuronen sind in der Nähe genug, Rekonstitution des GFP-Moleküls zu gestatten und setzt die Existenz einer Synapse. Griff kann Synapsen falsch, jedoch melden, wenn zwei Zellen eng Membranen, wie in einem Nerv oder Faszikel apposed haben. Varianten von GRASP beseitigen solche Fehlalarme durch begrenzen der präsynaptischen Fragments der GLP direkt an Synaptobrevin, wodurch Rekonstitution nur bei aktiven Synapsen8. Während Griff und seine Varianten Bestimmung funktionelle Verknüpfung bei der Drosophila CNS beigetragen haben, können einige Verbindungen nicht sichtbar gemacht werden durch Verständnis wenn die Abstände zwischen Prä- und postsynaptischen Partner ist relativ groß. Dies ist besonders relevant bei der Bewertung der Lautstärke Übertragung Neuromodulation9 oder GABAergen Hemmung10zugeordnet.
Hier zeigt sich eine ergänzende und neuartige Technik zum Testen monosynaptischen Direktverbindungen in Drosophila CNS. Diese Methode, genannt Tetrodotoxin entwickelt Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN), funktioniert durch Co Ausdruck von Tetrodotoxin (TTX)-resistenten Natrium-Kanal, NaChBac und Aktivator optogenetische in einer präsynaptischen Zelle während der Aufnahme von vermeintlichen postsynaptischen Partner9. In Anwesenheit von TTX wird alle Aktionspotential-vermittelte Aktivität in den Zellen als die mit dem Ausdruck NaChBac unterdrückt. Der NaChBac-Kanal wird selektiv Erregbarkeit in die gezielte präsynaptischen Zellen bei schönem Licht-evozierten synaptische Übertragung wiederhergestellt. Diese Methode ermöglicht starke Aktivierung der präsynaptischen Neuronen, so dass Verbindungen postsynaptically durch somatische Aufnahme und reduziert die Wahrscheinlichkeit von recruiting polysynaptische Schaltungen gelöst werden können. Wichtig ist, diese Technik erlaubt die Untersuchung der Volumen-Übertragung und zeigt die Verbreitung des Senders aus ein einzelnes Neuron in einer Schaltung entlassen. Darüber hinaus können Terpen die chemische Natur der Verbindung durch konventionelle Pharmakologie offenbaren. Terpen eignet sich für den Einsatz in jedem Modellsystem, das die transgenen Ausdruck der TTX-unempfindliche Natriumkanäle ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UAS-csChrimson</td>
			<td style="width:219px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:344px;">55135</td>
			<td style="width:167px;">Used as a neural activator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UAS-NaChBac</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9466</td>
			<td style="width:167px;">Resotores excitibility in cells in TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tetrodotoxin</td>
			<td>Tochris</td>
			<td>1078</td>
			<td style="width:167px;">Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">all trans-Retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td>
			<td>R2500</td>
			<td style="width:167px;">Require co-factor for channelrhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Weldable 321 Stainless Steel&#160;Sheet,&#160;0.002&#34;&#160;Thick,&#160;10&#34;&#160;Wide</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection of preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Waxer</td>
			<td>Almore</td>
			<td>Eectra Waxer 66000</td>
			<td style="width:167px;">Used during dissection to secure fly in foil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraffin Wax</td>
			<td>Joann</td>
			<td>4917217</td>
			<td style="width:167px;">Used with waxer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Number 5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#5CO</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection and desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td style="width:167px;">Used to remove parts of the cuticle during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797500</td>
			<td style="width:167px;">Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Reciculating Peristaltic Pump</td>
			<td>Simply Pumps (Amazon)</td>
			<td>PM200S</td>
			<td style="width:167px;">for recirculating TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Speed Controller for peristaltic pump</td>
			<td>Zitrades (Amazon)</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Versa-Mount&#160;Precision Compressed Air Regulator</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td style="width:344px;">1804T1</td>
			<td style="width:167px;">For applying positive pressure during patching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capilaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:344px;">TW150F-3</td>
			<td style="width:167px;">For patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multipurpose Gauge</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3846K431</td>
			<td style="width:167px;">Gauge for pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrophysiology Camera</td>
			<td>Dage MTI&#160;</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td style="width:167px;">Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IR LED</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>M850F2</td>
			<td style="width:167px;">For oblique illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fiber optic for IR LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M89L01</td>
			<td style="width:167px;">Couples to IR LED</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 40X</td>
			<td>LUMPlanFLN</td>
			<td style="width:167px;">This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amber LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M590L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing RFP and mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GFP filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49011</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Custom mCherry Filter Set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td style="width:344px;">&#160;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td>
			<td style="width:167px;">Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dichroic to combine Amber and blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:344px;">DMLP550R</td>
			<td style="width:167px;">Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Red LED</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>Cree XPE 620 - 630 nm</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LED Driver</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>3021-D-E-1000</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td style="width:167px;">Used to position pipette during recordings</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patchclamp Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 2400</td>
			<td style="width:167px;">An equivalent amplifier is suitable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bessel Filter</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>LPF 202A</td>
			<td style="width:167px;">Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Data Acquisition System&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI PCIe-6321&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 781044-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to record data from amplifier to computer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>779556-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to connect amplifier to DAQ card.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Foil&#160;</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Steel foil for custom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnets</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D42</td>
			<td style="width:167px;">To secure recording chamber to ring stand</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">1/16&#34; Cell Cast Acrylic Clear</td>
			<td>Pololu</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.

Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und tes...

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Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Untersuchen Local Network Processing mit Multi-Contact-Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Forschung

Neurowissenschaften

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

Korrelation von Verhaltensreaktionen auf fMRI Signalen von Human präfrontalen Kortex: Untersuchung kognitiver Prozesse mit dem Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections

Entschlüsselung der Rolle diskreter Bereiche des Rattengehirns bei der Regulation des Eisprungs durch reversible Inaktivierung durch Tetrodotoxin-Mikroinjektionen

Many experimental approaches have been used for studying the role of the brain in the regulation of ovulation. Examples include the lesion and ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Eine standardisierte Pipeline zur Untersuchung der Morphometrie der menschlichen zerebellären grauen Substanz mittels struktureller Magnetresonanztomographie

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...