Name: high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires titi et Hancock pour adjoint et discussion scientifique. Les auteurs remercient Andrew Neilson, Ph.d. (Virginia Tech) pour la fourniture de la fraction de monomère de cacao épicatéchine dérivée. Cette étude a été financée par une subvention de la Diabetes Action Research and Education Foundation à JST.

1. Culture cellulaire
<ol><li>Dérivée de la culture INS-1 832/13 cellules bêta RPMI 1640 additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine, 10 mM HEPES, 2 mM de Glutamine, 1 mM de Pyruvate de Sodium et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Éliminer les cellules 832/13 un flacon T75 avec 2 mL de 0,25 % de tryp...

<ol>
	<li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC2+(GLUT)+family+of+membrane+transporters.">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li><li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders.">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li><li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+cocoa+catechins+enhance+&#946;-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration.">Monomeric cocoa catechins enhance &#946;-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li><li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells.">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion.">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li><li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells:+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia.">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).</li><li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos.">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors.">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li><li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway.">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854 (2015).</li><li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation.">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).</li><li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity.">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities,+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction.">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li><li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db/db+mice.">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).</li><li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver.">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li><li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential.">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li><li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-Activated+Mitochondrial+Phospholipase+iPLAgamma+Prevents+Lipotoxic+Oxidative+Stress+in+Synergy+with+UCP2,+Amplifies+Signaling+via+G-Protein-Coupled+Receptor+GPR40,+and+Regulates+Insulin+Secretion+in+Pancreatic+beta-Cells.">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li><li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets.">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li></ol>

L’objectif du présent protocole est de respirométrie haute résolution permet de mesurer le taux respiratoires intactes les cellules bêta du pancréas. Cette méthode permet la mesure de la réponse de la cellule bêta à une augmentation de la glycémie. Le protocole permet également pour le prétraitement avec divers composés, comme l’a démontré dans ce protocole avec les naturels monomère épicatéchine ou curcumin4,5</su...

L’objectif principal de la cellule bêta pancréatique est de maintenir la normoglycémie système par le biais de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Les cellules bêta du sens des changements physiologiques dans le glucose en grande partie en raison de la faible affinité, transporteur de glucose de haute capacité GLUT2 circulant (Glucose Transporter 2 Km 16,7 mM)1. Augmentation des niveaux de glucose circulatoire, ce transporteur de faible affinité de grande capacité facilite une augmentation proportionnelle de glucose intracellulaire au sein de la cellule bêta. Glucose est métabolisé par la glycolyse et le cycle de Krebs (cycle des acides tricarboxyliques), la respiration mitochondriale entraînant des concentrations élevées d’ATP (adénosine triphosphate) cellulaire. La concentration élevée d’ATP bloque les canaux ATP sensibles K+ , ce qui entraîne une dépolarisation membranaire. Dépolarisation membranaire provoque l’ouverture des canaux de Ca2 + voltage dépendant et la libération subséquente de vésicule lié l’insuline granules2. Dysfonction des cellules bêta est une caractéristique du diabète de Type 2 (T2D) et se traduit par la sécrétion d’insuline diminuée et mal maîtrisée et, finalement, de la mort de cellules bêta3. Mécanismes de maintiennent ou d’améliorer la fonction des cellules bêta pourraient servir comme traitement pour T2D.
Des études ont démontré les effets bénéfiques de l’origine naturelle des composés à base de plantes sur les cellules bêta du pancréas4. Ces composés peuvent avoir leur effet par la prolifération de cellules bêta croissante, la survie ou la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. À titre d’exemple, des études récentes ont démontré que monomère épicatéchine améliore la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par l’augmentation de la respiration mitochondriale et augmentant l’ATP cellulaire niveaux5. Par conséquent, comprendre comment ces composés peuvent augmenter fonctionnelle des cellules bêta masse est important de tirer parti de ces composés comme agents thérapeutiques potentiels.
La respiration cellulaire peut être mesurée par un certain nombre d’outils. Utilisation d’un respiromètre haute résolution permet pour le titrage des modulateurs chimiques pour une population de cellules perméabilisées ou intact6. Cet outil permet l’ajout de composés divers, à des concentrations différentes, donnant ainsi un large éventail d’informations.
Étant donné le lien intime entre le métabolisme du glucose et la fonction des cellules bêta, mesures de la respiration cellulaire sont essentiels. Mesures de la respiration cellulaire peuvent se faire à l’aide de cellules bêta perméabilisées soit intacts, avec chacun ayant son propre ensemble d’avantages et inconvénients7,8. Alors que la perméabilisation des cellules bêta permet de mesurer les différents aspects de la chaîne de transport d’électrons, il le fait sans ce qui concerne le mécanisme d’induction de la respiration dans la cellule bêta, la captation du glucose et le métabolisme. Utilisation de la respiration des cellules bêta unpermeabilized est donc une technique très utile pour déterminer la réponse des cellules bêta à divers niveaux de glucose, à l’aide de la consommation d’oxygène comme la lecture.
Cette technique vise à mesurer la consommation d’oxygène intact INS-1 dérivé de cellules bêta 832/13. Cette technique nous permet de déterminer la réponse des cellules bêta aux conditions unstimulatory de glucose (glycémie 2,5 mM) ainsi que les conditions de stimulateur de glucose (glycémie 16,7 mM). Alors que les cellules unpermeabilized ne nous permettent pas de tester individuellement les complexes I, II ou III de l’électron chaîne de transport, la technique permet-elle de mesures portant sur la respiration de l’inhibition (oligomycine A), dételle complexe IV (FCCP-Carbonyl cyanide- 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone) et inhibe complètement la respiration (l’antimycine A). Cette étude démontre l’efficacité de la mesure de la respiration chez les cellules bêta du pancréas unpermeabilized intactes, ainsi que l’effet de deux composés naturels, épicatéchine monomère et curcumine, sur la respiration cellulaire bêta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>O2k Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>Instrument for high-resolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 6 Program</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>27141-01</td>
			<td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INS-1 832/13 cell line</td>
			<td>Duke University Medical Center</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7727</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocoa epicatechin monomer</td>
			<td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>832/13 beta cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>GLL01</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7979</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anitmycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determining protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

Haute résolution respirométrie permet la mesure de la consommation d’oxygène des mitochondries isolées, les cellules et les tissus. Cellules bêta jouent un rôle essentiel dans l’organisme de contrôle de la glycémie par le biais de la sécrétion d’insuline en réponse à des concentrations élevées de glucose. La sécrétion d’insuline est contrôlée par le métabolisme du glucose et de la respiration mitochondriale. Mesurer la respiration de la cellule bêta intacte est donc essentiel d’être en mesure d’améliorer la fonction des cellules bêta comme traitement pour le diabète. En utilisant intact 832/13 INS-1 dérivé des cellules bêta, nous pouvons mesurer l’effet de l’augmentation de la concentration de glucose sur la respiration cellulaire. Ce protocole permet de mesurer la respiration cellulaire bêta en présence ou en absence de composés différents, permettant de déterminer l’effet de donné composés sur la respiration cellulaire intacte. Nous démontrons l’effet de deux composés naturels, épicatéchine monomère et curcumine, sur la respiration des cellules bêta sous la présence de faible (2,5 mM) ou des conditions de forte concentration de glucose (16,7 mM). Cette technique peut servir à déterminer l’effet de divers composés sur la respiration de la cellule bêta intacte en présence de différentes concentrations de glucose.

INS-1 832/13 des cellules bêta qui sont préparés et récoltées comme décrit dans le protocole fera la démonstration de modulation de la consommation d’oxygène basés sur les diverses interventions chimiques (Figure 1 a). On observera une augmentation de la respiration lorsque la concentration de glucose est augmentée à 16,7 mM Glucose (Figure 1 b). La respiration diminue lorsque les cellules intactes sont traités avec l’oligomycine A. Cette respira...

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

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