Name: investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00
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La Fundación Lundbeck, Universidad de Aarhus, Dandrite y Lundbeck A/S apoyaron este trabajo.

Nota: Realizar todos los pasos a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario y mantener reservas en hielo o en el frigorífico (excepto de la elución de búfer que contienen SDS). El protocolo se divide en 5 secciones: las muestras de la preparación de RNA; preparación de granos para IP; Unión de la ARN BrU-labelled para granos; elución y purificación de RNA encuadernado BrU-etiquetados por extracción con fenol-fenol/cloroformo-cloroformo 3 pasos; Análisis de ARN (en este ejemplo utilizando RT-qPCR)<...

<ol>
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Este protocolo describe el uso de BrU-IP para determinación de la producción de RNA por etiquetado de nuevo produce RNA para 1 h con BrU, seguido por la inmediata extracción de RNA e inmunoprecipitación de ARN marcado con BrU. Este método ha sido descrito previamente en la referencia16, y este artículo incluye algunos pasos adicionales para aumentar la especificidad IP y pureza del RNA, por granos pre-tratamiento con concentraciones bajas de BrU, así como un paso de purificación de fenol-c...

5-Bromouridine (BrU) inmunoprecipitación (IP) permite el estudio de la producción de RNA en células con n o efectos muy limitados sobre la fisiología de la célula durante el breve período1,2de etiquetado. El método se basa en la incorporación del derivado sintético de la uridina BrU en el RNA recién sintetizado seguido por IP de ARN marcada con anticuerpos anti-BrU (figura 1).
Se ha sabido por décadas que la síntesis de proteínas puede ser regulada transcripcionalmente, y la existencia de factores de transcripción fue presumida hace más de 50 años3. Hoy en día, se sabe que varias enfermedades son causadas por la desregulación de la estabilidad del RNA y transcripción (suplementario S1 figura en la referencia4), y la capacidad para medir los cambios en la producción de RNA es de gran importancia en la enfermedad de comprensión desarrollo.
Por otro lado, las herramientas para regular la producción de RNA proporcionan nuevas posibilidades para el tratamiento de enfermedades causadas por la expresión de proteína demasiado o muy poco, o acumulación de la proteína tales como la enfermedad de Parkinson (EP). La proteína predominante de acumulación de agregados insolubles como en la EP es la α-sinucleína, y el nivel de α-sinucleína está directamente relacionado con la enfermedad, como la multiplicación del gen del gen α-sinucleína causa familiar PD5. Por otra parte, α-sinucleína agregados de manera dependiente de la concentración. Regulación a la baja de niveles de mRNA de α-sinucleína, resulta una estrategia terapéutica interesante, que se ha logrado con éxito utilizando ARN de interferencia para disminuir la pérdida de células neuronales en modelos de roedores de PD6,7.
Es importante poder medir los cambios en la producción de RNA causado por enfermedad o intervenciones terapéuticas. Estado de la técnica métodos para medir niveles de estado estacionario del ARN, como transcripción reversa seguida de reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (RT-qPCR), no son capaces de distinguir entre los cambios causados por la regulación transcripcional o alterado Estabilidad del RNA. Un método ampliamente utilizado para la investigación de las tasas de decaimiento de RNA está bloqueando de la maquinaria transcripcional con compuestos tales como α-amanitin o actinomicina D seguido de medidas de los RNAs que se decae. Sin embargo, hay algunos problemas asociados con una obstrucción total de la transcripción en células, como la inducción de apoptosis8,9. Al lado de los efectos citotóxicos, transcripcionales inhibidores también presentan varios problemas técnicos, como la lenta absorción celular de α-amanitin y falta de especificidad de la actinomicina D (revisado en la referencia10).
Para evitar la obstrucción total de la transcripción, se han utilizado análogos de nucleótido, como 5-ethynyl uridina (UE 5), 4-thiouridine (4-TU) y BrU. Estos son fácilmente tomados por las células mamíferas e incorporados en el RNA recién sintetizado, que pulso-etiquetado de ARN dentro de un marco de tiempo específico. BrU es menos tóxico que la UE-5 y 4-TU, lo que es el análogo recomendado: opción11,12.
BrU-IP puede utilizarse para investigar tanto la tasa de síntesis de ARN y la estabilidad y así distinguir entre las causas de los cambios en el ARN total. Este artículo se centrará en la medición de la síntesis de ARN y se refiere a la referencia2 para más detalles sobre la investigación de la estabilidad del RNA. Para investigar la síntesis de ARN, las células se etiquetan brevemente con BrU por ejemplo para 1 h seguida de BrU-IP1 (figura 1). Esto permite mediciones de ARN sintetizado en el corto plazo etiquetado y cambios observados le dará una mejor estimación de las regulaciones en la síntesis de RNA que midiendo cambios en el ARN total por RT-qPCR. Sin embargo, debe mencionarse que a pesar de que el tiempo de etiquetado es, por ejemplo, sólo 1 h, degradación todavía puede tener una influencia en los niveles de RNA observados.
ARN de experimentos de BrU-IP son adecuados para análisis posterior por RT-qPCR1 o la siguiente generación de la secuencia2,13. Otros métodos de detección de RNA estándar, tales como el borrar norteño o ensayo de protección de ribonucleasa, también pueden ser aplicables para ciertos RNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ribolock Rnase inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman RNA probes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td>
			<td>Flurogenic probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR system</td>
			<td colspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &#956;g/&#956;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xBrU-IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &#956;g/&#956;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

Cuando se comparan los niveles de estado estacionario RNA entre dos condiciones, no es posible distinguir si los cambios son causados por alteraciones en la producción o degradación de RNA. Este protocolo describe un método para la medición de la producción de RNA, utilizando 5-Bromouridine etiquetado de RNA seguido por la inmunoprecipitación, que permite la investigación de ARN sintetizado en un corto plazo (p. ej., 1 h). La ventaja de 5-Bromouridine-etiquetado e inmunoprecipitación sobre el uso de tóxicos inhibidores transcripcionales, como α-amanitin y actinomicina D, es que hay no o muy poco efectos sobre la viabilidad celular durante el uso a corto plazo. Sin embargo, porque 5-Bromouridine-inmunoprecipitación solo captura RNA producido en el corto plazo etiquetado, producido lentamente como degrada rápidamente RNA puede ser difícil de medir por este método. El RNA marcado con el 5-Bromouridine capturado por la 5-Bromouridine-inmunoprecipitación puede analizarse por transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuencia de la generación siguiente. Todos los tipos de ARN pueden ser investigados, y el método no se limita a medir mRNA como se presenta en este ejemplo.

Nuestras pruebas iniciales de tiempo etiquetado BrU fueron realizados en células AsPC-1. Las células fueron tratadas con BrU, para 0, 1, 2 y 4.5 h, seguida por la extracción de RNA total y BrU-IP. Midieron a GAS5 y GAPDH en el ARN de BrU-IP, que ha demostrado que 1 h etiquetado era suficiente para alcanzar un cambio aproximadamente 9 - y 44 veces en comparación con fondo (0 h) de GAPDH y GAS5, respectivamente.
BrU-IP y el an...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Este método puede utilizarse para medir la síntesis de ARN. 5-Bromouridine se añade a las células e incorporado en el RNA sintetizado. Síntesis de ARN se miden por la extracción de RNA inmediatamente después del etiquetado, seguido de la inmunoprecipitación de 5 Bromouridine-orientada con RNA y análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Microarrays de ADN y ARN de alta densidad - Síntesis fotolitográfica, hibridación y preparación de grandes bibliotecas de ácido nucleico

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...