Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

وأيد هذا العمل 13GW0044 فكز منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث، ومشروع مورفيكوانت-3D. ونحن نشكر "بارتلز كارولين" للدعم التقني.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

طقم تلقت المبالغ المسددة "صكوك بويكيلير" لتوريد نموذج وظيفي لحامل الركيزة. تالر مارلين هو الموظف من زايس مجهرية GmbH، الشركة المصنعة لأنظمة المجهر المشار إليها في هذه المادة. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر زايس بعض الحلول مثل حزم الحل "زايس أطلس" لمجموعة واسعة من التطبيقات في مجال التصوير ثلاثي الأبعاد، ومساحة كبيرة للصكوك التعزيز-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة. ليس لها علاقة بالكشف عن جميع مؤلفين آخرين.

سير عمل لاستهداف خلايا معينة داخل أنسجة بالنقل المتعدد الوسائط في هرمية تجلى: عينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج هو شرائح إلى صفائف مقاطع المسلسل، التي يتم وضعها على الركازة موصلة باستخدام حامل الركيزة خصيصا. بعد وضع العلامات مع فلوروفوري والتصوير في FLM، يتم استخدام حجم أعيد بناؤها لتحديد الخلايا المستهدفة. بعد جولات تلطيخ إضافية مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض، يتم تصويرها هذه الأهداف على عدة أقسام مئات دقة النانو في SEM استخدام منصة برمجيات الآلي.
لإنتاج صفائف كثافة مع عدة شرائط طويلة، حامل الركيزة مشابهة لتلك الموضحة هنا ضروري. قد يكون شخص المريض وغير المهرة قادرة على إرفاق عدة شرائط الركازة سليكون، شبه مغمورة في زورق سكين, واسترداد الصفيف بخفض منسوب المياه تدريجيا حتى يجلسون الشرائط على الركازة. ومع ذلك، في تجربتنا، هناك ميل تحطيم تشكيل عند الركيزة لمس أي جزء من القارب سكين (انظر الملاحظة في 1.3.2 في البروتوكول). وبالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء أكثر صعوبة مع ركائز المغلفة إيتو: (1) نظراً لشفافية إيتو-الزجاج، من الصعب رؤية حافة الماء حيث قد ينتهي الأشرطة ترفق؛ و (2) لأن السطح المغلفة إيتو أخشن كثيرا من رقاقة السيليكون مصقول للغاية، الشرائط تميل إلى كسر أثناء الرفع وقد تعدت شظايا صغيرة تتألف من بعض الأقسام، وبالتالي تدمير ترتيب المقاطع.
من الممكن أيضا سير العمل كله دون الارتباط ببيانات FLM. وفي هذه الحالة، قد يكون جمع البيانات في وزارة شؤون المرأة القيام بها في عدة دورات. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد أولية أو على الأقل قد يكون من الضروري لتحديد أهداف التقييم البيانات دقة منخفضة أو متوسطة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تطبيق البقع النسيجي التقليدية برايتفيلد LM (التي لا تتطلب FLM). وبطبيعة الحال، هي الأخرى خيارات6،7،8 جسم وضع العلامات على الصفائف، كما تبين فعلا في الورقة الأولى في الساعة18، أو وراثيا ترميز البروتينات الفلورية (إكسفبس) أو قبل تضمين العلامات مع المحافظة على الأسفار أثناء إعداد عينة.
حد عامة لمناقشة الأسلوب هو استخدام المقاطع لسماكة معينة وعينات منفصلة الناتجة من الحجم الثلاثي الأبعاد: القرار في Z يمكن فقط جيدة مثل سمك الفروع منذ SEM بجمع البيانات فقط من سطح القسم (د ابيندينج على الطاقة الأولية الطاقة/الهبوط المحدد). وهذا يعني أن حجم ثلاثي الأبعاد الناتجة متباين فوكسيلس، على سبيل المثال.، 5 × 5 × 100 nm3 إذا 100 أقسام نانومتر وحجم بكسل صورة 5 نانومتر المستخدمة. لكيانات صغيرة جداً في نطاق حجم أدناه 1 ميكرومتر، وهذا قد لا تكون كافية لوصف ultrastructural حقيقية. هو القيد تقنية أكثر دقة المرحلة التي تستخدم في وزارة شؤون المرأة للتصوير الآلي. ونتيجة لهذا، من الضروري اختيار دوروا أكبر من مواصفات دقة المرحلة لضمان أن يتم تصويرها منطقة الهدف الكامل.
مقارنة SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز ككتلة-الوجه من أساليب التصوير، قد ستتحقق في نهائي ومن سيئات فوكسيلس متباين، كما هو موضح أعلاه. مع التعزيز-وزارة شؤون المرأة، يمكن الحصول على الخواص فوكسيلس 5 × 5 × 5 نانومتر3 عند تصحيح الانحراف سليم في المكان.
الثغرات في حجم أعيد بناؤها بسبب فقدان المقاطع أثناء إعداد مصفوفات يمكن أيضا قلق من أن عدم مصادفة مع SBF-وزارة شؤون المرأة أو التعزيز-وزارة شؤون المرأة. مع تثبيت الشريط جيدا بالغراء، وهذا عادة فقط مسألة للجزء الأخير من الشريط: قد يكون معطوباً عند إطلاقه من حد السكين تستخدم في جفن. ومع ذلك، في تجربتنا، الخسارة في قسم واحد في كل الأقسام 20 – 50 لا تؤثر تسجيل الصورة.
من ناحية أخرى، يمنح إمكانية مرحلة ما بعد وصمة عار صفائف إشارة جيدة والتباين للتصوير ووزارة شؤون المرأة، وحتى على عينات ميتاليزيد ضعيفة مثل ارتفاع الضغط المجمدة تلميحات الجذر هو موضح هنا. ولذلك، فإنه ليس من الضروري التوصل إلى حل وسط المحافظة ultrastructural الأمثل بالعديد من التثبيت الكيميائي وخطوات التلميع. أيضا، تقديم عينات روتينية من مختبر علم الأمراض بدرجات متوسطة من المعدنة بيانات ممتازة10. تعزيز النقيض بعد تضمين مثل هذه لا يمكن SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز بصورة عامة. وعلاوة على ذلك، وبهذه الطرق المدمرة، أيتستهلك العينة أثناء التصوير، هرمية التصوير في قرارات مختلفة ومواقع أو التصوير المتكرر في نقطة لاحقة في وقت مستحيل. من حيث المبدأ، إنشاء وحدات التخزين غير محدودة، تتألف من FOVs كبيرة (مثلاً، تصل إلى عدة ملليمترات للعقول الماوس كله في كونيكتوميكس) بخياطة الفسيفساء، وإعدادا هائلة من المقاطع يمكن اكتسابها من خلال تي، بينما في التعزيز-وزارة شؤون المرأة، FOVs تتجاوز 100 ميكرومتر µm x 100 ويصعب تحقيق مع الصكوك الروتينية.
زيادة التشغيل الآلي في وصف-سير العمل سيكون ميزة أكيدة، منذ تنفيذ الأساليب المذكورة أعلاه SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز تمزيقها والتصوير داخل نفس الصك بطريقة مؤتمتة بالكامل على حد سواء. يوجد نوع واحد من التشغيل الآلي لتقطيع: "أتومتومي"12 ويمكن توليد وجمع آلاف مقاطع، ولكن استخدام Kapton الشريط الركازة يجعل مثل صفائف صعبة للصورة في FLM. على كوفيرسليبس إيتو المغلفة المستخدمة هنا، ينبغي أن يكون تصوير القرار فائقة حتى ممكن. وسيكون هدف مرغوب فيه جداً، وكذلك لأتمتة تسجيل رزمة البيانات FLM. من ناحية أخرى، التشغيل الآلي يمكن أن تكون مكلفة وفيما عدا صاحب الركازة، يعتمد سير العمل المقدمة هنا (من حيث الأجهزة) فقط على الأجهزة التي تتوفر عادة في م روتينية مرفق المختبر أو الأساسية، مما يجعل من انخفاض مستوى الوصول.

لإعادة بناء كميات كبيرة من الأنسجة بدقة ultrastructural عدد من النهج التصوير مختلفة استناداً إلى وزارة شؤون المرأة قد تم المستخدمة1: استعراضات شاملة متوفرة على سبيل المثال., SBF-وزارة شؤون المرأة2والتعزيز-وزارة شؤون المرأة3الصفيف التصوير المقطعي (في)4. بينما للأسلوب الأخير هو الحفاظ على المواد عينة كمجموعة مقاطع المسلسل على الركازة، SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز هي الأساليب المدمرة، تعمل على كتلة العينة واستهلاكها أثناء التصوير. بسبب فرض الراتنج في وزارة شؤون المرأة، أنها تعتمد أيضا على كتل عينة ميتاليزيد بقوة5.
من ناحية أخرى، تحديد بعض الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام داخل عينة أنسجة يمكن أن تستفيد خصوصا من الضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)6،،من78. استخدام FLM لاستهداف يحول دون تطبيق كميات كبيرة من المعادن الثقيلة منذ هذا شأنه إخماد إشارة fluorescence9. لهذه العينات metalized قليلاً فقط، هو في طريقة الاختيار منذ صفائف يمكن بسهولة بعد الملون مع المعادن الثقيلة بعد تصوير LM. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقريبا أي نوع من أنواع العينة لفي, عينات روتينية حتى من الطبيب كنز الصدر10.
هي ميزة كبيرة أخرى في إمكانية هرمية11 أو التصوير المتعدد القرار12: ليس من الضروري صورة كل شيء في الاستبانة، كما يمكن تحديد الأهداف بطريقة مختلفة (مثلاً، FLM) أو في الصور المنخفضة الوضوح ووزارة شؤون المرأة. تصوير المناطق المثيرة للاهتمام فقط من السكان الأنسجة أو الخلايا في الاستبانة يوفر مساحة تخزين البيانات الرقمية وتنتج مجموعات بيانات الصورة أصغر، وأسهل للتعامل. هنا، هو أثبت سير العمل في استخدام عينة بل metalized ضعيفة: الضغط العالي تجميد جذور النبات (نبات التمويل) جزءا لا يتجزأ من الراتنج ماء.
يتم شرح كيف أعد لمصفوفات والملون وتصويرها في FLM ووزارة شؤون المرأة، وكيف تسجل رصات الصور. أيضا، يتضح كيف يمكن استخدام إعادة حجم FLM 3D لتحديد خلايا معينة للتصوير في وزارة شؤون المرأة بدقة النانو.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

يمكن استهداف الخلايا المحددة في القرار ultrastructural داخل خلايا مختلطة سكان أو أنسجة بتصوير التسلسل الهرمي باستخدام مزيج من الضوء والمجهر الإلكتروني. مقطوع في صفائف تتألف من شرائط المئات من المقاطع سامسونج عينات جزءا لا يتجزأ من راتنج وأودعت في قطعة من رقاقة السيليكون أو كوفيرسليبس كوندوكتيفيلي المغلفة. صفائف يتم تصويرها بدقة منخفضة باستخدام مستهلك رقمية مثل كاميرا الهاتف الذكي أو مجهر الضوء (LM) لمحة سريعة مساحة كبيرة، أو مجهر الأسفار ميدانية واسعة (الفلورية الخفيفة الميكروسكوب (FLM)) بعد وضع العلامات مع فلوروفوريس. بعد بعد تلطيخ مع المعادن الثقيلة، صفائف يتم تصويرها في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). من الممكن اختيار الأهداف من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة FLM أو من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد مصنوعة من الكدسات SEM الصورة بدقة متوسطة في حالة توفر لا علامات مضيئة. لتحليل ultrastructural، تسجل الأهداف المحددة وأخيراً في وزارة شؤون المرأة في الاستبانة (بضعة نانومتر الصورة بكسل). ويتجلى أداة التعامل مع الشريط الذي يمكن تحديثه وتعديله لأي أولتراميكروتومي. وهو يساعد مع مجموعة الإنتاج وإزالة الركيزة من القارب سكين تقطيع. وتناقش منصة برمجيات يتيح التصوير الآلي للمصفوفات في وزارة شؤون المرأة. مقارنة بالأساليب الأخرى توليد البيانات كبيرة الحجم م، مثل الوجه كتلة المسلسل SEM (SBF-وزارة شؤون المرأة) أو تركيز أيون شعاع (التعزيز-وزارة شؤون المرأة)، ووزارة شؤون المرأة وهذا النهج قد اثنين من المزايا الرئيسية: (1) المحافظة عليها العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، لو في إصدار شرائح إلى أعلى. يمكن أن تكون ملطخة بطرق مختلفة وتصويرها مع قرارات مختلفة. (2) كما يمكن أن تكون المقاطع الملون بعد، فإنه ليس من الضروري استخدام عينات الملطخة بشدة من كتلة مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض لتصوير SEM أو تقديم كتل الأنسجة الموصلة. وهذا يجعل الطريقة التي تنطبق على مجموعة واسعة من المواد والمسائل البيولوجية. مسبوقة وبخاصة المواد مثلاً، من المصارف خزعة ومختبرات علم الأمراض، يمكن مباشرة المضمنة وإعادة بنائها في 3D.

ووصف سير العمل هنا يبدأ (الشكل 1) مع عينة جزءا لا يتجزأ من كتلة راتنج. أثناء إعداد عينة، ينبغي إدخال بعض المعادن الثقيلة في الأنسجة، ولكن ليس من الضروري استخدام البروتوكولات الأمثل للتلميع قوية بدلاً من ذلك. ويبين الشكل 1A جذر نبات (الرشاد) كتلة الملطخة تقليديا مع 1% أوسو4 و metalized خلات اليورانيل 1%، بينما جذر نبات في الشكل 1B ضعيف فقط استخدام خلات اليورانيل 0.5%. نوع النموذج الأخير الأنسب للنهج ستتحقق كما تميل بعض المعادن الثقيلة إخماد الأسفار. مع حامل الركيزة مخصصة (الشكل 2)، يمكن أن تكون صفائف من عدة مئات من المقاطع المنتجة (الشكل 1). بعد وضع العلامات الفلورية، مثل هذه الصفائف تصويرها في FLM واسع المجال قياسي (الشكل 1)، ثم ملطخة بحلول المعادن الثقيلة وتصويرها في وزارة شؤون المرأة في قرارات مختلفة (الشكل 1E–ز).
أدوات هامة لتوليد استنساخه من المصفوفات، خاصة عند وضع عدة أشرطة من سكين قارب مبضع على الركازة، هي حامل الركيزة (الشكل 2A، خصيصا في مختبر صاحبي) والماس جامبو سكين بقارب كبيرة بما يكفي لاستيعاب شرائح المجهر (الشكل 2). غضروف مسطح، مما يتيح مراقبة جيدة من الشرائط، ضروري، ويمكن أن يتحقق عن طريق تنظيف البلازما من الركازة: قطره صغيرة من الماء المقطر لا ينبغي أن يشكل بنية تشبه العدسة على الركازة كما في الشكل 2 (الركيزة غير المعالجة)، لكن طبقة رقيقة (الشكل 2D، الركيزة البلازما المنشط). في ظل هذه الظروف، شرائط تعلق على الجزء الجاف من ساترة إيتو المغلفة بسهولة تصور (الشكل 2E) ويمكن ملاحظة والتحكم أثناء الرفع من الركازة من الماء.
على سبيل مثال، تم تصويرها صفائف ملطخة يوديد propidium لتسمية جدران الخلايا النباتية مع حقل واسع قياسية FLM (الشكل 3A). نظراً للمقاطع فقط 100 نانومتر سميكة، حتى يلطخ الإفراط كما هو موضح هنا يدخل طمس قليلاً. بعد التسجيل، واختيرت الخليتين محاطة تماما بحجم أعيد بناؤها من المكدس الصورة (الشكل 3B) لتصوير عالي الدقة في 3D (انظر أيضا تكميلية الفيلم S1). على أثر تلطيخ إضافية مع سترات خلات والرصاص اليورانيل، تم تصويرها في الصفيف في sem. الشكل 3 جيم يبين نظرة عامة، تسجل مع 60 بكسل صورة نانومتر؛ ساحة مظلمة في وسط الصورة يشير إلى الموضع حيث أعدم مهام ضبط تلقائي للصورة، وجرعة إضافية أدت إلى تلوث طفيف. المناسبة رويس في تلك الأبواب المسلسل (شرائح 51 إلى 248 من شرائح 435 في المجموع) التي تحتوي على الخلايا الهدف الثاني المحدد في المكدس FLM سجلت ثم مع حجم بكسل صورة شمال البحر الأبيض المتوسط 5 (3D الشكل؛ انظر أيضا تكميلية الفيلم S2).
كان يتم تصوير هرمية الآلي من الصفائف في SEM الموصوفة هنا مع الحل منصة برمجيات ومعدات زايس أطلس 5. أولاً، لمحة عامة عن الصفيف بالكامل تم إنشاؤه باستخدام كاشف سراج الدين، مع كبير جداً (1,000 nm) صورة بكسل والوقت يسكن منخفضة جداً (الشكل 4 أ). دوروا تبين أنسجة فقط على القسم الأول ونشرها إلى جميع الأقسام الأخرى من الصفيف. ثم سجلت مجموعة المقطع هذه مع 60 نانومتر بيكسلات الصورة استخدام وقت يسكن أطول (الشكل 4 باء). وأخيراً، أنشئت مجموعة موقع التي تحتوي على الخلايا الهدف اثنين زائد واحد "طبقة" المحيطة بالخلايا لمراعاة عدم دقة المرحلة، مع المعلمات التالية: كشف حساب الضمان باء (الطاقة تشتت ارتدادي الانتقائي)، 5 نانومتر الصورة بكسل، طويلة جداً (40 المايكروثانيه) يسكن الوقت ( 4 الشكل). التكبير لمثل هذه صور يظهر التفاصيل سوبسيلولار (الشكل 4) مثل الميتوكوندريا (M) ونواة (N)، فاكوليس (V) وهيولي (الأسهم). انظر أيضا تكميلية فيلم S3 للتكبير من لمحة عامة عن مجموعة كاملة للتفاصيل سوبسيلولار للخلية الهدف واحد.
الصفيف هو موضح هنا (مقاطع 200) بالإضافة إلى أحد الأقسام 250 استغرق حوالي 8 ح لإنتاج إضافية، ليلة واحدة وصمة عار LM، ويوم واحد لتسجيل (يدوياً) في FLM. بعد تلطيخ يستغرق حوالي 1-2 ح في المجموع، اعتماداً على عدد الصفائف الفردية. المطلوبة لتسجيل وزارة شؤون المرأة، وبضع ساعات لإعداد تشغيل نظام أطلس، والتسجيل الآلي كان ح 3 – 4 لمجموعة القسم (60 شمال البحر الأبيض المتوسط الحجم بكسل) القرار المتوسطة (أقسام 200, 450 × 200 ميكرومتر2) وحوالي 5 أيام الاستبانة (5 نانومتر حجم بكسل) عائد الاستثمار تحتوي على خلايا الهدف الثاني (200 المقاطع، 55 x 30 ميكرون2). لاحظ أنه بسبب انخفاض المحتوى المعدني للعينة المعروضة هنا، أن سرعة مسح بطيئة جداً استخدامها للوصول إلى الكشف عن إشارة إلى الضوضاء جيدة، مما يعني (لكشف المتاحة حاليا) وقت يسكن المايكروثانيه 40 للعائد على الاستثمار ذات الدقة العالية.
هناك العديد من الخطوات في سير العمل كله عرضه للمخاطر: ومن الناحية المثالية ينبغي أن تكون شرائط أكثر أو أقل مباشرة ووضعها في الترتيب الصحيح (الشكل 5A). ومع ذلك، غالباً ما تنتج بنت (الشكل 5B) أو المنحنى (الشكل 5)، أو شرائط حتى كسر. يمكن أن ينتج هذا بسبب اقتطاع غير صحيحة (الرائدة وحواف خلفية موازية ليست بالضبط)، أو لاصقة التطبيقية غير موحد، بل أيضا من نموذج غير متماثل أو غير متساو تسلل. مزعجة لا سيما العينات التي تحتوي على مكونات ناعمة ومن الصعب جداً على حد سواء. مكونات هذا الأخير قد يكون من الصعب على التسلل مثل جدار الخلية من جذور النباتات المعروضة هنا (الشكل 5). في هذه الحالة، يمكن أن يكون سبب طيات (رؤوس) بسهولة بضغط متغير والاسترخاء خلال تمزيقها. للألى التصوير في وزارة شؤون المرأة، شرائط منحنية لا يمثل مشكلة كبيرة، حيث يمكن تدويرها في رويس لاستيعاب انحناء الشريط.
هو تلطيخ خطوة حاسمة أخرى في البروتوكول: الغسيل غير كافية يمكن أن تؤدي إلى المخلفات في المقطع (الشكل 5E، و)، وفي أسوأ الأحوال، تغطي المنطقة الأكثر إثارة للاهتمام (دائرة في إحدى الخلايا الهدف الثاني في الشكل 5F). أيضا، الغبار (الشكل 5، جسيمات تشتت الضوء بشدة) أدخلت القارب سكين، مثلاً، مع ناقل الركازة قذرة، يمكن أن يسبب مشاكل خطيرة: في FLM، يمكن أن يكون الغبار الفلورية العالية (انظر بعض الشرائح في "الفيلم تكميلية" S1) إلى درجة أن بعض الخوارزميات التسجيل لا تعمل. الدالة "محاذاة" في تراكيم17 ومع ذلك، يمكن التعامل مع هذه المكدسات كما هو موضح في تكميلية الفيلم S1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> رقم 1: سير العمل لتصوير هرمية الارتباطية. بدءاً من عينة جزءا لا يتجزأ من كتلة راتنج (A، عينة بشدة ميتاليزيد)، والعينة الأولى قلص (ب، عينة metalized ضعيفة) وثم صفائف تتألف من عدة شرائط من مقاطع المسلسل (ج)، وضعت هنا على ساترة المغلفة إيتو، يتم إنتاجها باستخدام أولتراميكروتومي. بعد صبغة بصبغة فلورسنت، تسجل أكوام من الصور في FLM واسع المجال (د). بعد زيادة تلطيخ جولات مع المعادن الثقيلة الأملاح، يتم تصويرها مكدسات في SEM (ه–ز) في قرارات مختلفة (أحجام بكسل صورة). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> رقم 2: أدوات لإعداد مصفوفات. حامل الركيزة التي يتم تجميعها من ميكرومانيبولاتورس مع سبعة محاور حركة تعلق على أولتراميكروتومي قياسية (A): المسامير، وأبرزت مع الدوائر، حركة (2) الأفقي والرأسي (1) وآماله (3) من الناقل الركيزة . سكين الماس جامبو مع زورق كبيرة الحجم لاستيعاب ركائز الكبيرة (السهم)، هنا مع قطعة من رقاقة السيليكون المنشط البلازما التي شنت على ناقل ألومنيوم الحجم الشريحة (ب). 20 ميليلتر قطرات الماء المقطر وضعها على الركازة رقاقة سليكون غير معالجة (ج) أو على الركازة المنشط البلازما (د). أربعة أشرطة عائمة في زورق سكين, موصولة إلى ساترة إيتو المغلفة بغاياتها أقل. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> الشكل 3: العلاقة بين البيانات LM مع بيانات وزارة شؤون المرأة- نظرات عامة (، ج) والخلايا المستهدفة (ب، د) المسجلة مع FLM (، ب) ووزارة شؤون المرأة (ج، د). (ب) تكبير برمجيات، والبيانات الأصلية وسجلت مع عدسة هدف X 40 على رقاقة كاميرا 1,388 x 1,040 بكسل، بينما تسجل مع 60 حجم بكسل الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط، و (د) (ج) مع 5 حجم بكسل الصورة في شمال البحر الأبيض المتوسط، التي توضح الحقيقية زيادة في القرار في sem. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> الشكل 4: هرمية التصوير في SEM "زايس أطلس 5 يجيدون" استخدام نظرة عامة على صفيف سجلت 1,000 بيكسلات الصورة نانومتر باستخدام كاشف سراج الدين (A). ويعرض القسم مع العائد على الاستثمار على الأنسجة في كل قسم وسجلت مع بيكسلات الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط 60 (ب). يحدد الموقع مع عائد مسلسل على الخلايا الهدف وسجلت مع بيكسلات الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط 5 (ج). عند التكبير في مثل هذه الصور ذات الدقة العالية (د)، تصبح مرئية المقصورات غشاء داخل الخلايا مثل فاكوليس (V) ونواة (ن) الميتوكوندريا (M) هيولى (الأسهم). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> الرقم 5: مشاكل نموذجية. 1-الناشئة عن عملية تقطيع: قد يسبب شرائط على ضغط مثالي على التوالي (A)، ولكن عدم انتظام كوفيرسليبس المغلفة إيتو أثناء تقطيع بنت (ب) أو شرائط منحنية (د)، أو حتى طيات (ج). 2-الناجمة عن التعامل مع الركيزة وشرائط في المياه، مثلاً، من خلال تمزيقها وتلطيخ: ضوء نثر الجسيمات في الطبقة السفلية (د)، ريم قطرات على المقطع (دائرة في ه) أو الاوساخ لطخت بها عبر الأنسجة بسبب عدم كفاية الغسيل بعد تلطيخ (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
تكميلية الفيلم S1: المكدس الصورة FLM. الصور 435 الانحياز في فيجي16 استخدام تراكيم17 وحفظها كملف الفيلم (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
تكميلية الفيلم S2: المكدس الصورة SEM. محاذاة الصور 210 في فيجي16 استخدام تراكيم17. وكان المكدس الأصلي (300 الصور) مجموعة البيانات هذه 15 غيغابايت. إلى تقليص حجم المكدس من 3.3 غيغابايت (بعد المحاذاة والاقتصاص فقط هما استهداف الخلايا)، تم تحجيمه في x y بمقدار 0.2 باستخدام فيجي وثم حفظه كفيلم.avi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
تكميلية فيلم S3: التكبير مع مستويات دقة مختلفة في sem. التي تم إنشاؤها في الفيلم وتصديرها من برنامج أطلس 5 في تنسيق.mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

ويستهدف هذا البروتوكول خلايا معينة في الأنسجة للتصوير بدقة النانو باستخدام المسح الإلكتروني المجهري (SEM). أولاً يتم تصويرها أعدادا كبيرة من مقاطع المسلسل من المواد البيولوجية جزءا لا يتجزأ من الراتنج في مجهر خفيفة لتحديد الهدف ومن ثم بطريقة هرمية في sem.

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

التوسع و أديبوجينيسيس تحريض الأسلاف خلية شحمية من الأنسجة الدهنية حول الأوعية معزولة من قبل المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...