Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door grant FKZ 13GW0044 van het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek, project MorphiQuant-3D. Wij danken Carolin Bartels voor technische ondersteuning.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

KIT heeft ontvangen vergoedingen door Boeckeler instrumenten voor de levering van een functioneel model van de houder van het substraat. Marlene Thaler is vaste medewerker van ZEISS microscopie GmbH, fabrikant van de systemen van de Microscoop genoemd in dit artikel. Daarnaast biedt de ZEISS bepaalde oplossingen zoals ZEISS Atlas oplossingspakketten voor een brede waaier van toepassingen in groot-area, 3D imaging voor SEM en FIB-SEM instrumenten. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Een workflow voor het richten van specifieke cellen binnen een weefsel door multimodale hiërarchische AT bleek: een monster hars-embedded is gesneden omhoog in arrays van seriële secties, die in een geleidende substraat met behulp van een speciaal ontworpen substraat-houder worden gebracht. Na labelen met een fluorophore en beeldvorming in de DLM, wordt het gereconstrueerde volume gebruikt voor het selecteren van de doelcellen. Na kleuring van extra rondes met zware metalen om contrast, zijn deze doelstellingen beeld over meerdere honderd secties op nanoschaal resolutie in een SEM met behulp van een geautomatiseerde softwareplatform.
Voor de productie van dichtbevolkte verpakt arrays met verschillende lange linten, is een vergelijkbaar is met de hier beschreven substraat-houder nodig. Een bekwame en geduldige persoon mogelijk verschillende linten hechten aan een ondergrond van silicium, semi-ondergedompeld in de mes-boot, en de matrix op te halen door de waterstand geleidelijk te verlagen totdat de linten op de drager vervagen zitten. Echter, in de onze ervaring, er is een neiging om te verbrijzelen vorming wanneer het substraat is aanraakt de boot mes (cf. nota in 1.3.2 in protocol). Deze procedure is bovendien veel moeilijker met ITO-gecoate ondergronden: (1) door de transparantie van de ITO-glas, is het moeilijk om te zien de rand van het water waar de uiteinden van de linten hebben moeten worden gevoegd; en (2) omdat het ITO-gecoate oppervlak veel ruwer dan de zeer gepolijst silicium wafer is, de linten hebben de neiging te breken tijdens lift-out en kleinere fragmenten uit een paar secties kunnen zweven, dus het vernietigen van de volgorde van de secties.
De hele workflow is ook mogelijk zonder correlatie met FLM gegevens. In dit geval wellicht verzamelen van de gegevens in de SEM in meerdere sessies worden uitgevoerd. Een eerste 3D reconstructie of op zijn minst evaluatie van gegevens met lage of middelgrote resolutie kunnen nodig zijn ter specificatie van de doelen. Daarnaast kunnen conventionele histologische vlekken voor helderveld LM (niet vereisen FLM) worden toegepast. Natuurlijk zijn andere opties6,7,8 antilichaam etiketten op de arrays, zoals al blijkt in het eerste papier op in18, genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten (XFPs) of vooraf te embedding labeling met behoud van fluorescentie tijdens de bereiding.
Een algemene beperking van de besproken methode is het gebruik van secties van een bepaalde dikte en de resulterende discrete bemonstering van het 3D-volume: resolutie in Z kan alleen worden zo goed als de dikte van de secties aangezien de SEM alleen gegevens van de oppervlakte van de sectie (d verzamelt epending op de energie van de primaire energie/landing geselecteerd). Dit betekent dat het resulterende 3D-volume anisotrope voxels, bijv heeft., 5 x 5 x 100 nm3 als 100 nm secties en een afbeelding pixelgrootte van 5 nm worden gebruikt. Voor zeer kleine entiteiten in een grootte onder 1 µm, dit kan niet voldoende moeten zijn voor een echte ultrastructurele beschrijving. Een meer technische beperking is de nauwkeurigheid van de etappe in de SEM gebruikt voor geautomatiseerde imaging. Wegens dit is het noodzakelijk om te kiezen een ROI groter is dan de specificaties van de stadium nauwkeurigheid te garanderen dat de volledige doelgebied is beeld.
Vergeleken met de SBF-SEM en FIB-SEM als blok-gezicht beeldvormende methoden, heeft oereenstemming AT het definitieve nadeel van anisotrope voxels, zoals hierboven beschreven. Met FIB-SEM, kan isotrope voxels van 5 x 5 x 5 nm3 worden verkregen wanneer een juiste drift correctie op zijn plaats is.
Hiaten in het gereconstrueerde volume als gevolg van verlies van secties tijdens voorbereiding van arrays mogelijk ook een bron van zorg die niet wordt aangetroffen met SBF-SEM of FIB-SEM. Met goede lint stabilisatie door lijm, dit is meestal alleen een probleem voor het laatste gedeelte van een lint: het is mogelijk beschadigd wanneer het vrijgeven van het uit het scherp van de snede met behulp van de wimpers. Echter in onze ervaring, heeft het verlies van één sectie in elke 20 – 50 secties geen invloed op beeldregistratie.
Aan de andere kant, verleent de mogelijkheid om post vlek matrices goed signaal en het contrast voor SEM imaging, zelfs op zwak gemetalliseerde monsters zoals de hogedruk bevroren wortel tips hieronder. Daarom is het niet nodig om optimale ultrastructurele behoud door talrijke chemische fixatie en metallisatie stappen compromissen te sluiten. Routine monsters van de pathologie lab met tussenliggende graden van metallisatie leveren ook uitstekende gegevens10. Dergelijke een post inbedden contrastverbetering is niet mogelijk voor SBF-SEM en FIB-SEM in het algemeen. Bovendien, aangezien deze methoden destructieve zijn, dat wil zeggen, consumeren van het monster tijdens imaging, hiërarchische beeldvorming bij verschillende resoluties en sites of herhaalde imaging op latere tijdstippen in tijd is onmogelijk. In principe, onbeperkt volumes, bestaande uit grote FOVs (b.v., tot enkele millimeters voor hele muis hersenen in connectomics) gemaakt door stiksels mozaïeken en massaal secties kunnen worden verworven door AT, terwijl in FIB-SEM, FOVs dan 100 µm x 100 µm zijn moeilijk te bereiken met de gebruikelijke instrumenten.
Verdere automatisering van de beschreven AT-werkstroom zou een duidelijk voordeel, aangezien de bovengenoemde methodes SBF-SEM en FIB-SEM zowel afdelen en beeldvorming in hetzelfde instrument in een volledig geautomatiseerde wijze uitvoeren. Een soort van automatisering van afdelen bestaat: de ATUMtome12 kunt genereren en verzamelen duizenden secties, maar het gebruik van Kapton tape als een substraat dergelijke maakt arrays moeilijk naar afbeelding in een FLM. Op de ITO-gecoate coverslips hier gebruikt, moet zelfs Super resolutie beeldvorming mogelijk. Een verdere, zeer wenselijk doel voor automatisering zou de opname van het FLM gegevensstacks. Aan de andere kant, automatisering kan duur en met uitzondering van de houder van de ondergrond, de werkstroom gepresenteerde afhankelijk (in termen van hardware) alleen instrumentatie meestal beschikbaar in een routine EM laboratorium of core faciliteit, waardoor het lage niveau van toegang.

Voor de wederopbouw van grote hoeveelheden weefsel bij ultrastructurele resolutie zijn een aantal verschillende beeldvormende benaderingen gebaseerd op SEM gebruikte1: uitgebreide reviews zijn beschikbaar bv., voor de SBF-SEM2, FIB-SEM3en Array Tomografie (AT)4. Terwijl voor de laatste methode is het monstermateriaal bewaard als een matrix van seriële secties op een substraat, zijn SBF-SEM en FIB-SEM destructieve methoden, bezig met het monster blok en consumeert tijdens imaging. Als gevolg van het in rekening brengen van de hars in de SEM, hangen zij ook sterk gemetalliseerde monster blokken5.
Aan de andere kant, kan identificatie van bepaalde cellen of structuren van belang binnen een weefsel monster profiteren met name van oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)6,7,8. Met behulp van FLM voor targeting sluit de toepassing van grote hoeveelheden van heavy metal aangezien dit zou de fluorescentie signaal9doven. Voor deze enige enigszins gemetalliseerde monsters is AT de methode van keuze omdat arrays mogelijk gemakkelijk na gebeitst en heavy metal na LM imaging. Bovendien, bijna elk type van de steekproef kan worden gebruikt voor AT, zelfs routine monsters van de patholoog van schat borst10.
Een ander groot voordeel van AT is het potentieel voor hiërarchische11 of multi-resolutie beeldvormende12: het is niet nodig om het imago van alles in hoge resolutie, zoals doelstellingen kunnen worden geselecteerd in een verschillende modaliteit (bijvoorbeeldFLM) of in lage SEM resolutiebeelden. Imaging alleen de interessante regio's van de bevolking van een weefsels of cellen op hoge resolutie digitale data-opslag ruimtebesparing en produceert kleinere datasets van de afbeelding, die gemakkelijker te hanteren. Hier, de AT-werkstroom wordt aangetoond door middel van een nogal zwak gemetalliseerde monster: hogedruk bevroren plantenwortels (Arabidopsis thaliana) ingebed in de hydrofiele hars.
Hoe de arrays worden voorbereid, gekleurd, en beeld in zowel FLM en SEM, en hoe de afbeeldingsstapels worden geregistreerd worden toegelicht. Ook, hoe de 3D reconstructie van het FLM-volume kan worden gebruikt voor het selecteren van bepaalde cellen voor beeldvorming in de SEM op nanoschaal resolutie wordt geïllustreerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Gericht op specifieke cellen op ultrastructureel resolutie binnen een populatie van gemengde cel of een weefsel kan worden bereikt door de hiërarchische geschikt zijn met behulp van een combinatie van de licht- en elektronenmicroscopie. Monsters in de hars ingesloten zijn gesegmenteerd in arrays bestaande linten van honderden uiterst dunne secties en gestort op stukken van silicium wafer of conductively gecoate coverslips. Arrays zijn beeld met een lage resolutie met behulp van een digitale consument zoals smartphone camera of lichte Microscoop (LM) voor een overzicht van de snelle groot gebied, of een breed veld fluorescentie Microscoop (fluorescentie lichte microscopie (FLM)) na het labelen met fluorophores. Na na kleuring met zware metalen, zijn matrices beeld in een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Selectie van de doelen is mogelijk vanuit 3D-reconstructies gegenereerd door FLM of vanuit 3D-reconstructies gemaakt van de SEM-afbeeldingsstapels op tussenliggende resolutie als geen fluorescente markeringen beschikbaar zijn. Ultrastructurele p.a., geselecteerde doelen worden uiteindelijk opgenomen in de SEM op hoge resolutie (een paar nanometer afbeeldingspixels). Een lint-handling tool die kan worden ingebouwd om eventuele ultramicrotome wordt aangetoond. Het helpt met matrix productie en verwijdering van het substraat vanaf de vectorafbeeldingsbestanden mes boot. Een softwareplatform waarmee geautomatiseerde beeldvorming van matrices in de SEM wordt besproken. Vergeleken met andere methoden voor het genereren van grote hoeveelheden EM gegevens, zoals seriële blok-gezicht SEM (SBF-SEM) of gerichte ion beam SEM (FIB-SEM), deze aanpak heeft twee grote voordelen: (1) het hars-embedded monster wordt behouden, zij het in een gesneden-up versie. Het kan op verschillende manieren gekleurd en beeld met verschillende resoluties. (2) zoals de secties post kunnen worden gekleurd, is het niet nodig om monsters sterk blok-gekleurd met zware metalen te introduceren contrast voor SEM imaging of maken het weefsel blokken geleidende. Dit maakt de methode die van toepassing zijn op een grote verscheidenheid van materialen en biologische vragen. Met name vastgestelde materialen b.v.uit biopsie banken en pathologie labs, kunnen direct worden ingesloten en gereconstrueerd in 3D.

De workflow beschreven hier (Figuur 1) begint met een steekproef ingebed in een blok hars. Tijdens de bereiding van de monsters, sommige zware metalen moet worden ingevoerd in het weefsel, maar het is niet nodig te gebruiken protocollen geoptimaliseerd voor vrij sterke metallisatie. Figuur 1A blijkt een wortel van de plant (tuinkers) blok gebeitste conventioneel met 1% OsO4 en 1% uranyl acetaat, terwijl de Arabidopsis wortel in figuur 1B slechts zwak is gemetalliseerde met behulp van 0,5% uranyl acetaat. Het laatste voorbeeld type is geschikt voor oereenstemming benaderingen zoals sommige zware metalen hebben de neiging om quench fluorescentie. Met een speciaal substraat houder (Figuur 2), matrices van verschillende honderden punten kunnen worden geproduceerd (Figuur 1 c). Na tl labelen, zijn dergelijke arrays beeld in een standaard breed-gebied FLM (Figuur 1 d), en vervolgens gekleurd met heavy metal oplossingen en beeld in een SEM bij verschillende resoluties (figuur 1E--G).
Belangrijke instrumenten voor de reproduceerbare generatie van arrays, zijn met name bij het plaatsen van diverse linten vanaf van de microtoom mes boot op een substraat, de substraat houder (figuur 2A, douane-ontworpen in de auteurs laboratorium) en een Jumbo-diamant mes met een boot groot genoeg is voor Microscoop dia's (figuur 2B). Een platte meniscus, waardoor goede observatie van de linten, noodzakelijk is en kan worden bereikt door het plasma reinigen van de ondergrond: een kleine druppel gedestilleerd water moet niet vormen een lens-achtige structuur op het substraat zoals in figuur 2C (onbehandeld substraat), maar een dunne film (figuur 2D, plasma geactiveerd substraat). Onder deze omstandigheden, linten aangesloten op het droge deel van een dekglaasje ITO beklede aan zijn gemakkelijk gevisualiseerd (figuur 2E) en kan worden waargenomen en gecontroleerd tijdens het lift-out van het substraat vanaf het water.
Als voorbeeld, werden matrices gekleurd met propidium jodide aan het label van de celwanden van planten beeld met een brede standaardveld FLM (figuur 3A). Aangezien de secties alleen 100 zijn nm dik, zelfs overdreven kleuring zoals hier introduceert weinig vervagen. Na registratie, werden de twee cellen volledig ingesloten in het gereconstrueerde volume geselecteerd uit de afbeeldingsstapel (figuur 3B) voor hoge resolutie imaging in 3D (Zie ook Aanvullende film S1). Extra vlekken met uranyl acetaat en lood citraat, naar aanleiding van de arrays zijn beeld in de SEM. Figuur 3 C toont een overzicht, opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels; de donkere plein in het midden van de afbeelding geeft de positie waar de autofocus functies zijn geëxecuteerd, en de extra dosis leidde tot lichte verontreiniging. Passende ROIs in deze seriële secties (segmenten 51 tot en met 248 van 435 segmenten in totaal) met de twee Doelcellen geselecteerd in de stack FLM vervolgens werden opgenomen met een 5 nm pixel Afbeeldingsgrootte (figuur 3D; Zie ook Aanvullende film S2).
Geautomatiseerde hiërarchische beeldvorming van de matrices in de SEM hier beschreven werd gedaan met de software/hardware platformoplossing ZEISS Atlas 5. Ten eerste, een overzicht van de hele array is gemaakt met behulp van de SE detector, met zeer groot (1000 nm) afbeelding pixels en zeer lage Nadruktijd (figuur 4A). Een ROI waarin alleen het weefsel was geplaatst op de eerste sectie en doorgegeven aan alle andere secties van de matrix. Deze sectie set werd vervolgens opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels met behulp van een langere Nadruktijd (figuur 4B). Tot slot, een set van de site, met de twee doelcellen plus een "laag" van de omringende cellen ter verantwoording voor fase onnauwkeurigheid, opgericht met de volgende parameters: ESB (energie selectieve Backscatter) detector, 5 nm afbeelding pixels, zeer lange (40 µs) wonen tijd ( Figuur 4C). Inzoomen op een dergelijke afbeelding toont subcellular detail (Figuur 4 d) zoals vacuolen (V), mitochondriën (M), nucleus (N) en endoplasmatisch reticulum (pijlen). Zie ook de Aanvullende film S3 voor het inzoomen van een overzicht van de hele array voor de subcellular detail aan één van de doelcel.
De array die hier weergegeven (200 punten) plus een extra een van 250 secties nam ongeveer 8 h tot het produceren, één nacht om vlek voor LM, en een dag om te registreren (handmatig) op de FLM. Na kleuring duurt ongeveer 1-2 h in totaal, afhankelijk van het aantal afzonderlijke matrices. Voor SEM-opname, een paar uur zijn verplicht om in te stellen naar de Atlas-run, en geautomatiseerde opname was 3-4 h voor de tussenliggende resolutie (60 nm pixelgrootte) sectie set (200 secties, 450 x 200 µm2) en ongeveer 5 dagen voor de hoge resolutie (5 nm pixelgrootte) ROI die bevatten de twee doelcellen (200 secties, 55 x 30 µm2). Merk op dat als gevolg van de lage metalen inhoud van hiernaast afgebeeld, een zeer langzame scanner vaart moest worden gebruikt om te bereiken van een goede detectie van signal-to-noise, die (voor de momenteel beschikbare detector) een Nadruktijd 40 µs voor de hoge ROI impliciet.
Er zijn verschillende stappen in de hele workflow vatbaar voor valkuilen: idealiter linten moet min of meer rechte en geplaatst in de juiste volgorde (figuur 5A). Echter, gebogen (figuur 5B), gebogen (figuur 5D) of zelfs gebroken linten worden vaak geproduceerd. Hierdoor kunnen als gevolg van onjuiste trimmen (toonaangevende en trailing randen niet precies parallel), of niet-eenvormige wijze worden toegepast lijm, maar ook uit een asymmetrische of ongelijk geïnfiltreerde monster. Bijzonder lastig zijn monsters die zowel zeer harde als zachte componenten bevatten. De laatste onderdelen kunnen moeilijk te infiltreren zoals de celwand van de plantenwortels hier weergegeven (figuur 5C). In dat geval kunnen plooien (pijlpunten) gemakkelijk worden veroorzaakt door variabele compressie en ontspanning gedurende het segmenteren. Voor geautomatiseerd beeldvorming in de SEM, zijn gebogen linten niet een groot probleem, aangezien de ROI kunnen worden gedraaid om de kromming van het lint aan te passen.
Een andere belangrijke stap in het protocol is kleuring: onvoldoende wassen kan leiden tot residuen op de sectie (figuur 5E, F), en in het ergste geval, bestrijken de meest interessante gebied (cirkel op een van de twee doelcellen in figuur 5F). Ook, stof (figuur 5D, sterk lichtverstrooiing deeltjes) geïntroduceerd in de mes boot, bijvoorbeeldmet een vuile substraat vervoerder, kan ernstige problemen veroorzaken: In de DLM, stof kunnen zeer TL (vgl. sommige segmenten in aanvullende film S1) tot dermate dat sommige registratie-algoritmen niet werken. De functie "align" in TrakEM17 is echter dergelijke stapels zoals aangetoond in Aanvullende film S1aankan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figuur 1: Workflow voor de oereenstemming hiërarchische beeldvorming. Een steekproef vanaf ingebed in een blok hars (A, sterk gemetalliseerde monster), het monster is eerste bijgesneden (B, zwak gemetalliseerde monster) en vervolgens arrays hier bestaande uit verschillende linten van seriële secties (C), geplaatst op een ITO-gecoate dekglaasje aan, zijn geproduceerd met behulp van een ultramicrotome. Na kleuring met een fluorescente kleurstof, stapels van beelden geregistreerd in een breed-gebied FLM (D). Na verdere kleuring rondes met zware metalen zouten, zijn stapels beeld in een SEM (E--G) bij verschillende resoluties (grootte van de pixel van de afbeelding). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figuur 2: hulpmiddelen voor de bereiding van arrays. Substraat houder samengesteld uit micromanipulators met zeven assen van verkeer aangesloten op een standaard ultramicrotome (A): de schroeven, gemarkeerd met cirkels, zijn verticaal (1) en horizontale (2) beweging en kantelen (3) van de vervoerder substraat . De jumbo diamant mes met een oversize boot voor grote substraten (pijl), hier met een stuk van plasma-activated silicium wafer gemonteerd op een dia en middelgrote aluminium drager (B). 20 µL druppels gedestilleerd water op een onbehandelde silicium wafer substraat (C) of op een substraat van plasma-activated (D) gelegd. Vier linten drijvend in de mes-boot, aangesloten op een dekglaasje ITO beklede aan door hun lagere doeleinden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figuur 3: correlatie van de LM-gegevens met gegevens van de SEM. Overzichten (A, C) en doelcellen (B, D) opgenomen met FLM (A, B) en SEM (C, D). (B) is een software-zoom, en de oorspronkelijke gegevens werden geregistreerd met een 40 X-objectief op een 1,388 x 1,040 pixel camera chip, terwijl (C) wordt geregistreerd met 60 pixelgrootte van de afbeelding van nm, en (D) met 5 nm pixel beeldgrootte, ter illustratie van de ware toename van de resolutie in de SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figuur 4: hiërarchische beeldvorming in de SEM met ZEISS Atlas 5 te Overzicht van een array opgenomen met 1.000 nm afbeeldingspixels met behulp van de SE detector (A). Sectie wordt ingesteld met de ROI op weefsel in elke sectie geplaatst en opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels (B). Site wordt ingesteld met een seriële ROI op doelcellen geplaatst en opgenomen met 5 nm afbeeldingspixels (C). Bij het inzoomen in dergelijke hoge resolutie beelden (D), membraan van intracellulaire compartimenten zoals vacuolen (V), nucleus (N), mitochondriën (M) en endoplasmatisch reticulum (pijlen) zichtbaar worden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figuur 5: typische problemen. 1. als gevolg van de vectorafbeeldingsbestanden proces: linten geplaatst op ITO beklede coverslips zijn ideaal rechte (A), maar onregelmatige compressie tijdens afdelen gebogen (B) of gebogen linten (D), of zelfs plooien (C) kunnen veroorzaken. 2. veroorzaakt door behandeling van substraat en linten in water, bijvoorbeeldtijdens het segmenteren en kleuring: licht verstrooiing deeltjes op substraat (D), rand van druppels op sectie (cirkel in E), of het vuil besmeurd uit over weefsel als gevolg van onvoldoende het wassen na kleuring (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende film S1: DLM afbeeldingsstapel. 435 afbeeldingen uitgelijnd in Fiji16 met behulp van TrakEM17 en als filmbestand (AVI) opgeslagen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film S2: SEM afbeeldingsstapel. 210 afbeeldingen uitgelijnd in Fiji16 met behulp van TrakEM17. De oorspronkelijke stapel (300 afbeeldingen) deze gegevensset was 15 GB. Om te krimpen de stack van 3,3 GB (na uitlijning en bijsnijden om alleen de twee cellen target), deze werd aangepast in x en y met een factor van 0,2 met behulp van Fiji en vervolgens opgeslagen als AVI-film. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film S3: inzoomen met de resolutie van de verschillende niveaus in de SEM. Film in gemaakt en geëxporteerd vanuit de Atlas 5-software in .mp4 formaat. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Dit protocol is gericht op specifieke cellen in weefsels voor beeldvorming op de nanoschaal resolutie met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Groot aantal seriële secties uit biologisch materiaal hars-embedded zijn eerste beeld in een lichte Microscoop te identificeren van het doel, waarna in een hiërarchische wijze in de SEM.

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...