Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par 13GW0044 FKZ subvention du ministère fédéral allemand pour l’enseignement et de recherche, projet MorphiQuant-3D. Nous remercions Carolin Bartels pour le support technique.

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KIT a reçu des remboursements par Boeckeler Instruments pour la fourniture d’un modèle fonctionnel de la porte-substrat. Marlene Thaler est employé de ZEISS microscopie GmbH, fabricant des systèmes microscope mentionnées dans cet article. En outre, ZEISS propose certaines solutions comme les packages de solution ZEISS Atlas pour un large éventail d’applications en grande surface, 3D imagerie pour instruments SEM et FIB-SEM. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Un flux de travail afin de cibler des cellules spécifiques dans un tissu par multimodale AT hiérarchique a été démontrée : un échantillon enrobées dans la résine est tranché vers le haut dans les tableaux de coupes sériées, qui sont placés sur un substrat conducteur à l’aide d’un porte-substrat sur-mesure. Après marquage avec un fluorophore et imagerie de la FLM, le volume reconstruit est utilisé pour sélectionner les cellules cibles. Après que coloration supplémentaire tours avec des métaux lourds qui va présenter le contraste, ces objectifs sont imagés sur plusieurs sections de centaines à résolution nanométrique dans une SEM à l’aide d’une plate-forme logicielle automatisée.
Pour produire des tableaux avec plusieurs longs rubans, un porte-substrat similaire à celle décrite ici est nécessaire. Une personne habile et patiente peut être en mesure de fixer plusieurs rubans sur un substrat de silicium, semi immergé dans le bateau de couteau et de récupérer le tableau en abaissant progressivement le niveau d’eau jusqu'à ce que les rubans sont assis sur le substrat. Toutefois, dans le notre expérience, on a tendance à éclater en formation lorsque le substrat est en contact avec n’importe quelle partie du bateau couteau (cf. Remarque dans la section 1.3.2 dans le protocole). En outre, cette procédure est beaucoup plus difficile avec des substrats enduits ITO : (1) grâce à la transparence du verre-ITO, il est difficile de voir le bord de l’eau où les extrémités des rubans doivent être joints ; et (2) parce que la surface enduite ITO est beaucoup plus rude que la plaquette de silicium poli, les rubans ont tendance à casser pendant le levage et petits fragments composé de quelques tronçons peuvent flotter, détruisant ainsi l’ordre des sections.
Le workflow entier est aussi possible et sans corrélation avec les données de la FLM. Dans ce cas, la collecte de données dans le SEM peut-être avoir à accomplir lors de plusieurs séances. Une reconstruction 3D initiale ou du moins l’évaluation des données de faible ou moyenne résolution peut être nécessaire d’identifier les cibles. En outre, les colorants histologiques conventionnels pour fond clair LM (FLM pas exigeant) peuvent être appliqués. Bien sûr, les autres options6,,7,8 sont anticorps étiquettes apposées sur les tableaux, comme déjà démontré dans le document initial sur18, ou génétiquement codé protéines fluorescentes (XFPs) ou enrobage préalable d’étiquetage avec préservation de la fluorescence au cours de la préparation de l’échantillon.
Une limitation générale de la méthode discutée est l’utilisation de sections d’une certaine épaisseur et l’échantillonnage discret résultant du volume 3D : résolution en Z ne peut être aussi bonne que l’épaisseur des sections puisque la SEM recueille des seules données de la surface de section (d elon l’énergie énergie primaire/atterrissage sélectionné). Cela signifie que le volume 3D a voxels anisotropes, par exemple., 5 x 5 x 100 nm3 si 100 sections nm et une taille de pixel d’image de 5 nm sont utilisés. Pour les très petites entités dans une portée de taille inférieure à 1 µm, cela peut-être pas suffisante pour obtenir une vraie description ultrastructurale. Une limitation plus technique est la précision de la scène utilisée dans la SEM pour automatisé d’imagerie. Pour cette raison, il est nécessaire de choisir un retour sur investissement dépasse les spécifications de la précision de la scène afin de garantir que la zone cible complet est photographiée.
Par rapport à la SBF-SEM et FIB-SEM comme méthodes d’imagerie de l’îlot, corrélatif AT a le désavantage définitif de voxels anisotrope, tel que décrit ci-dessus. Avec FIB-SEM, des voxels isotropiques de 5 x 5 x 5 nm3 peut être obtenus lorsqu’une correction de dérive appropriée est en place.
Les lacunes dans le volume reconstruit en raison de la perte des articles lors de la préparation des tableaux peuvent être aussi un sujet de préoccupation qui n’est pas rencontrée avec SBF-SEM ou FIB-SEM Avec stabilisation bon ruban de colle, c’est habituellement seulement une question pour la dernière section d’un ruban : il pourrait être endommagé lorsque dégageant de la lame des couteaux à l’aide de la cil. Toutefois, selon notre expérience, la perte d’une section dans chaque sections de 20 à 50 n’influence pas d’image.
En revanche, la possibilité de colorer les tableaux confère bon signal et contraste pour l’imagerie SEM, même sur des échantillons faiblement métallisés comme l’anticyclone congelés apex racinaires illustré ici. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de compromettre la préservation optimale de nombreuses fixation chimique et les étapes de la métallisation. En outre, des échantillons de routine du laboratoire de pathologie avec des degrés intermédiaires de métallisation livrer excellentes données10. Une telle amélioration du contraste après incorporation n’est pas possible pour SBF-SEM et FIB-SEM en général. En outre, étant donné que ces méthodes sont destructeurs, c'est-à-direconsommer l’échantillon pendant l’imagerie, hiérarchique d’imagerie sur sites et différentes résolutions ou imagerie répété aux points plus tard dans le temps est impossible. En principe, volumes illimités, composé de grandes FOVs (p. ex., jusqu'à plusieurs millimètres de cerveaux de souris tout en connectomics) créé par piqûre des mosaïques, et grand nombre de sections peut être acquise par AT, tandis qu’en FIB-SEM, FOVs au-delà de 100 µm x 100 µm sont difficiles à atteindre avec des instruments courants.
Une automatisation supplémentaire du AT-workflow décrit serait un avantage certain, car les méthodes susmentionnées SBF-SEM et FIB-SEM effectuent de sectionnement et d’imagerie au sein d’un même instrument d’une manière entièrement automatisée. Il existe une sorte d’automatisation de sectionnement : The ATUMtome12 peut générer et collecter des milliers d’articles, mais l’utilisation de ruban Kapton comme un substrat fait de tels tableaux difficiles à l’image dans un FLM. Sur les lamelles de ITO-enduit utilisé ici, l’imagerie même Super-résolution devrait être possible. Une cible de plus, très souhaitable pour l’automatisation serait l’enregistrement des piles de données FLM. En revanche, automation peut être coûteuse et sauf pour le porte-substrat, le flux de travail présentée ici s’appuie (en termes de matériel) que sur l’instrumentation habituellement disponible dans une routine EM laboratoire ou core installation, rendant faible niveau d’accès.

Pour la reconstruction de grandes quantités de tissus à résolution ultrastructurale, un certain nombre de différentes méthodes d’imagerie basée sur SEM ont été utilisés1: révisions complètes sont disponibles par exemple., de SBF-SEM2, FIB-SEM3et tableau Tomographie (AT)4. Alors que pour cette dernière méthode, le matériau de l’échantillon est conservé sous forme de tableau de coupes sériées sur un substrat, SBF-SEM et FIB-SEM sont des méthodes destructives, travaillant sur le bloc de l’échantillon et qui la consomme en imagerie. En raison de la charge de la résine dans le SEM, elles dépendent aussi fortement métallisé échantillon blocs5.
D’autre part, identifier certaines cellules ou structures d’intérêt au sein d’un échantillon de tissu peut bénéficier en particulier lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM)6,7,8. À l’aide de FLM afin de cibler empêche l’application de grandes quantités de métaux lourds, car cela serait étancher le signal de fluorescence9. Pour ces seuls échantillons légèrement métallisés, AT est la méthode de choix car les tableaux peuvent être facilement après tachées et heavy metal, après imagerie LM. En outre, presque n’importe quel type d’échantillon peut être utilisé pour AT, des échantillons de même routine de la pathologiste au Trésor poitrine10.
Un autre grand avantage de la TA est la possibilité de hiérarchique11 ou multirésolution d’imagerie12: il n’est pas nécessaire de tout à haute résolution d’image, comme cibles peuvent être sélectionnés dans une modalité différente (par exemple, FLM) ou en images de basse résolution SEM. Seules les régions intéressantes d’une population de tissus ou de cellules à haute résolution d’imagerie économise de l’espace de stockage de données numériques et produit des petits ensembles de données d’image, qui sont plus faciles à gérer. Ici, le flux de travail AT est démontrée en utilisant un échantillon assez faiblement métallisé : haute pression gelé les racines des plantes (Arabidopsis thaliana) incorporé en résine hydrophile.
Les baies sont préparés, colorés et imagés en FLM et SEM et découvrez comment les piles d’image sont enregistrés sont expliqués. Aussi, comment la reconstruction 3D du volume FLM peut être utilisée pour sélectionner des cellules spécifiques pour l’imagerie de la SEM à résolution nanométrique est illustrée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Cibler des cellules spécifiques à résolution ultrastructurale au sein d’une population de cellules mixtes ou un mouchoir en papier est possible en imagerie hiérarchique à l’aide d’une combinaison de microscopie photonique et électronique. Échantillons embarqués en résine sont sectionnées en tableaux composé de rubans de centaines de coupes ultrafines et déposés sur des morceaux de tranche de silicium ou de lamelles en liaison conductrice avec enduit. Les tableaux sont imagés à basse résolution à l’aide un consommateur numérique comme appareil smartphone ou microscope photonique (LM) pour avoir un aperçu rapide de grande surface ou un microscope à fluorescence grand champ (microscopie photonique de fluorescence (FLM)) après marquage avec des fluorophores. Après coloration par des métaux lourds, les baies sont imagés dans un microscope électronique à balayage (SEM). Sélection des cibles n’est possible de reconstructions 3D générées par FLM ou de reconstructions 3D issues les piles SEM d’image à résolution moyenne, si aucun des marqueurs fluorescents ne sont disponibles. Pour les analyses ultrastructurales, cibles choisies sont tournées enfin la SEM à haute résolution (quelques pixels de l’image de nanomètre). Un outil de gestion ruban qui peut être modifié à n’importe quel ultramicrotome est démontré. Il aide à la production de tableau et enlèvement de substrat du bateau sectionnement de couteau. Une plate-forme logicielle qui permet l’imagerie automatisée des tableaux dans le SEM est discutée. Par rapport aux autres méthodes de production de données de grand volume EM, comme îlot série SEM (SBF-SEM) ou faisceau ionique focalisé SEM (FIB-SEM), cette approche présente deux avantages principaux : (1) l’échantillon enrobées dans la résine est conservée, mais dans une version en tranches. Il peut être teinté de différentes manières et imagé avec des résolutions différentes. (2) ainsi que les sections peuvent être soit des traités, il n’est pas nécessaire d’utiliser des échantillons fortement colorés à bloc avec des métaux lourds pour introduire le contraste pour l’imagerie SEM ou blocs de rendu de tissu conducteur. Cela rend la méthode applicable à une grande variété de matériaux et de questions biologiques. Matériaux particulièrement préfixée par exemple, de banques de biopsie et les laboratoires de pathologie peuvent directement être incorporé et reconstruit en 3D.

Le flux de travail décrit ici (Figure 1) commence avec un échantillon incorporé dans un bloc de résine. Au cours de la préparation de l’échantillon, certains métaux lourds devraient être introduit dans les tissus, mais il n’est pas nécessaire d’utiliser les protocoles optimisés pour métallisation assez forte. Figure 1 a montre une racine de plante (cress) bloc coloré classiquement avec 1 % OsO4 et 1 % acétate d’uranyle, tandis que la racine de l’Arabidopsis dans la Figure 1 b est seulement faiblement métallisé en utilisant l’acétate d’uranyle 0,5 %. Le type de ce dernier exemple est plus adapté pour approches corrélatifs comme certains métaux lourds ont tendance à étouffer la fluorescence. Avec un support dédié de substrat (Figure 2), les tableaux de centaines de plusieurs sections peuvent être produites (Figure 1). Après marquage fluorescent, tels tableaux est imagés dans un FLM de grand-angulaire standard (Figure 1), puis colorées avec des solutions de métaux lourds et photographiée sur un SEM à différentes résolutions (Figure 1E–G).
Des outils importants pour la génération reproductible des tableaux, en particulier lorsque vous placez plusieurs rubans de bateau couteau du microtome sur un substrat, sont le porte-substrat (Figure 2 a, conçu sur mesure en laboratoire des auteurs) et un diamant de Jumbo couteau avec un bateau assez grand pour accueillir des lames de microscope (Figure 2 b). Un ménisque plat, permettant la bonne observation des rubans, est nécessaire et peut être réalisé par plasma, nettoyage du substrat : une petite goutte d’eau distillée ne devrait pas constituer une structure en forme de lentille sur le substrat comme dans la Figure 2 (substrat non traitée), mais un film mince (Figure 2D, substrat de plasma activé). Dans ces conditions, les rubans attachés à la partie sèche d’une lamelle couvre-objet revêtu ITO sont facilement visualisée (Figure 2E) et peut être observée et contrôlée pendant la levée du substrat de l’eau.
À titre d’exemple, tableaux colorés à l’iodure de propidium d’étiqueter les parois cellulaires des plantes ont été photographié avec un champ large standard FLM (Figure 3 a). Les sections étant seulement 100 nm d’épaisseur, même trop de coloration comme indiqué ici introduit peu flou. Après l’enregistrement, les deux cellules encaissées dans le volume reconstruit ont été choisis dans la pile d’image (Figure 3 b) pour l’imagerie haute résolution en 3D (voir aussi le Supplément S1 du film). Après coloration supplémentaire avec citrate d’uranyle de l’acétate et le plomb, les baies ont été photographiés dans la SEM. Figure 3 C montre une vue d’ensemble, enregistré avec 60 pixels de l’image nm ; le carré sombre dans le centre de l’image indique la position où les fonctions de mise au point automatique ont été exécutées, et la dose supplémentaire a conduit à une légère contamination. Échéant des ROIs dans ces coupes sériées (tranches 51 à 248 de 435 tranches au total) contenant des cellules de deux cibles choisis dans la pile de la FLM étaient alors enregistrés avec une taille de pixel d’image nm 5 (Figure 3D; Voir aussi Supplemental film S2).
Automatisé imagerie hiérarchique des tableaux dans le SEM décrit ici a été fait avec la solution de plate-forme de logiciel/matériel ZEISS Atlas 5. Tout d’abord, un aperçu de l’ensemble a été créé à l’aide du détecteur SE, avec très grand (1 000 nm) image pixels et temps de demeure très faible (Figure 4 a). Un retour sur investissement décrivant uniquement les tissus a été placé sur la première section, puis propagée à toutes les autres sections du tableau. Cet ensemble de section est ensuite enregistré avec 60 pixels de l’image nm à l’aide d’un plus long temps de pause (Figure 4 b). Enfin, un ensemble de site, contenant les cellules deux cibles plus un « couche » qui entoure les cellules pour tenir compte de l’imprécision de la scène, a été mis en place avec les paramètres suivants : détecteur de ESB (rétrodiffusion sélective de l’énergie), image de nm 5 pixels, très longues (40 µs) habitent le temps ( Figure 4). Zoomer sur une telle image montre en détail subcellulaire (Figure 4) tels que les vacuoles (V), les mitochondries (M), noyau (N) et le réticulum endoplasmique (flèches). Voir aussi le S3 de film supplémentaire pour zoom avant d’un aperçu de l’ensemble au détail subcellulaire d’une cellule cible.
Le tableau ci-contre (200 articles) plus un supplément de 250 sections a pris environ 8 h pour produire, une nuit sur la tache pour LM et un jour enregistrer (manuellement) à la FLM. Après coloration prend environ 1-2 h au total, selon le nombre de tableaux individuels. Pour l’enregistrement de la SEM, quelques heures sont nécessaires pour configurer l’exécution de l’Atlas, et enregistrement automatisé a été de 3 à 4 h pour l’ensemble de section résolution moyenne (taille de pixel de 60 nm) (200 sections, 450 x 200 µm2) et environ 5 jours pour la haute résolution (5 nm taille en pixels) ROI contenant des cellules de deux cibles (200 sections, 55 x 30 µm2). Notez qu’en raison de la faible teneur en métal de l’exemple montré ici, une vitesse de balayage très lente devait être utilisée pour atteindre une bonne détection de signal-bruit, qui implique (pour le détecteur actuellement disponible) un temps de pause de 40 µs pour le ROI à haute résolution.
Il existe plusieurs étapes dans le workflow entier sujettes aux pièges : idéalement rubans devraient être plus ou moins droite et placé dans le bon ordre (Figure 5 a). Cependant, bent (Figure 5 b), courbe (Figure 5) ou même cassés rubans sont souvent produites. Ceci peut aboutir en raison de parage incorrect (attaque et bords de fuite pas parfaitement parallèles) ou adhésif non uniformément appliquée, mais aussi d’un échantillon d’asymétrique ou inégalement infiltré. Sont particulièrement gênants des échantillons contenant des composants douces et très durs. Les derniers éléments peuvent être difficiles à infiltrer tels que la paroi cellulaire des plantes racines ci-contre (Figure 5). Dans ce cas, les plis (pointes de flèches) peuvent facilement être causées par variable compression et détente pendant la découpe. Automatisé d’imagerie dans le SEM, rubans courbes ne sont pas un grand problème, puisque la ROIs peuvent être tournée pour tenir compte de la courbure du ruban.
La coloration est une autre étape essentielle dans le protocole : lavage insuffisant peut entraîner des résidus sur la section (Figure 5E, F) et dans le pire des cas, recouvrir la surface plus intéressante (cercle sur l’une des cellules deux cibles Figure 5F). En outre, poussière (Figure 5, les particules de diffusion de la lumière fortement) introduit dans le bateau de couteau, par exemple, avec un transporteur de substrat sale, peut causer de sérieux problèmes : dans la FLM, la poussière peut être très fluorescent (cf. quelques tranches dans film supplémentaire S1) à tel point que certains algorithmes d’enregistrement ne fonctionnent pas. La fonction « aligner » dans TrakEM17 , toutefois, peut gérer ces piles comme illustré dans le Supplément S1 du film.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figure 1 : Workflow pour l’imagerie hiérarchique corrélatif. À partir d’un échantillon incorporés dans un bloc de résine (A, échantillon fortement métallisé), l’échantillon est premier Paré (B, échantillon faiblement métallisé) et ensuite les tableaux consistant en plusieurs rubans de coupes sériées (C), placé ici sur un ITO-enduit lamelle couvre-objet, sont fabriqués avec un ultramicrotome. Après coloration avec un colorant fluorescent, piles d’images sont enregistrées dans un grand champ FLM (D). Après que coloration plus rondes et heavy metal, sels, les piles sont imagés dans un SEME–(G) à différentes résolutions (tailles pixel d’image). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figure 2 : outils pour la préparation de tableaux de. Porte-substrat assemblés à partir de micromanipulateurs avec sept axes de mouvement attaché à un ultramicrotome standard (A) : les vis, a mis en évidence avec des cercles, sont pour la verticale (1) et (2) déplacement horizontal et inclinaison (3) du transporteur substrat . Le couteau diamant jumbo avec un bateau surdimensionné pour accueillir de grands substrats (flèche), ici avec un morceau de gaufrette de silicium activé par plasma monté sur un support aluminium taille lame (B). 20 gouttes µL d’eau distillée placée sur un substrat de gaufrette de silicium non traitées (C) ou sur un substrat activé par plasma (D). Quatre rubans flottant dans le bateau de couteau, attaché à une lamelle de ITO-enduit par leurs extrémités inférieures. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figure 3 : corrélation des données avec des données SEM LM. Vue d’ensemble (A, C) et des cellules cibles (B, D) enregistrement avec FLM (A, B) et SEM (C, D). (B) est un zoom de logiciel et les données d’origine ont été enregistrées avec une lentille d’objectif X 40 sur une puce de 1 388 x 1 040 pixels appareil photo, tandis que (C) est enregistré avec 60 taille de pixel image nm et (D) avec 5 nm pixel taille de l’image illustrant le vrai augmentation de la résolution dans la SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figure 4 : hiérarchique d’imagerie dans le SEM à l’aide de ZEISS Atlas 5 AT. Vue d’ensemble d’un tableau enregistré avec 1 000 pixels de l’image nm en utilisant le détecteur SE (A). L’article définit avec le ROI placé sur le tissu dans chaque section et enregistré avec 60 pixels de l’image nm (B). Site des ensembles avec un retour sur investissement série placés sur des cellules cibles et enregistré avec 5 pixels de l’image nm (C). Lorsque vous zoomez dans ces images à haute résolution (D), compartiments de membrane intracellulaire comme vacuoles (V), noyau (N), (M) les mitochondries et le réticulum endoplasmique (flèches) deviennent visibles. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figure 5 : problèmes typiques. 1. compte tenu du processus de découpe : rubans placés sur les lamelles ITO-enduit compression sont idéalement droite (A), mais irrégulière au cours de la section peuvent causer un bent (B) ou rubans courbes (D) ou même des plis (C). 2. causés par la manipulation de substrat et rubans dans l’eau, par exemple, lors de coupes et de coloration : diffusion de particules sur le substrat (D) de la lumière, jante de gouttelettes sur la section (cercle E) ou de la saleté barbouillé dehors sur des tissus due à l’insuffisance lavage après coloration (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
S1 de film supplémentaire : pile FLM image. 435 images alignement en Fidji16 à l’aide de TrakEM17 et enregistré en tant que fichier vidéo (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
S2 de film supplémentaire : pile d’image SEM. 210 images alignées en Fidji16 à l’aide de TrakEM17. Le tapis de départ (300 images) de cet ensemble de données a été 15GO. Pour réduire la pile de 3,3 Go (après l’alignement et le recadrage à seulement deux cellules ciblent), il a été mis à l’échelle en x et y d’un facteur de 0,2 à l’aide de Fidji et puis enregistré sous film .avi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
S3 de film supplémentaire : zoom avec niveaux de résolution différente dans la SEM. Film créé en et exportés du logiciel Atlas 5 au format .mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Ce protocole cible les cellules dans le tissu pour l’imagerie à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide d’un microscope électronique à balayage (SEM). Un grand nombre de coupes sériées de matériel biologique enrobées dans la résine est imagé tout d’abord dans un microscope photonique à identifier la cible, puis de façon hiérarchique dans le SEM.

Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

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