Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 13GW0044 FKZ מהמשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר, פרוייקט MorphiQuant-3D. אנו מודים ברטל קרולין לקבלת תמיכה טכנית.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

ערכת קיבלה החזר על ידי מכשירי Boeckeler אספקה של מודל פונקציונלי של בעל המצע. מרלן Thaler הוא עובד של צייס מיקרוסקופ GmbH, יצרן של המערכות מיקרוסקופ שהוזכרו במאמר זה. בנוסף, ZEISS מציעה פתרונות מסוימים כגון אטלס ZEISS חבילות פתרון למגוון רחב של יישומים בתחום ההדמיה שטח גדול, 3D של כלי SEM, שיקרתי-SEM. כל המחברים האחרים אין לחשוף.

זרימת עבודה עבור מיקוד תאים ספציפיים בתוך רקמה על ידי AT הירארכי ומשולבות הודגם: מדגם שרף-מוטבע הוא חילקו לתוך מערכים של מקטעים סדרתי, אשר ממוקמות על מצע מוליך באמצעות בעל המצע אישית מעוצבת. לאחר תיוג עם fluorophore דימות in בסוף הצילומים, האחסון ששוחזר משמש לבחירת תאי היעד. לאחר צביעת נוספים סיבובים עם מתכות כבדות להציג ניגודיות, היעדים הללו הם צילמו לאורך מספר איזורים מאות ברזולוציה הננומטרי בעוד SEM באמצעות פלטפורמת תוכנה אוטומטיות.
להפקת מערכים בצפיפות עם מספר סרטים ארוכים, בעל מצע דומה לזו המתוארת כאן היא הכרחית. אדם מיומן וסבלני תוכל לצרף מספר סרטים מצע הסיליקון, שקוע למחצה סירה הסכין, ולאחזר את המערך על-ידי בהדרגה הנמכת מפלס המים עד הסרטים יושבים על המצע. עם זאת, לנוכח הניסיון שלנו, יש נטייה לנפץ היווצרות כאשר המצע נוגעת בכל חלק של הסירה את הסכין (cf. שים לב ב 1.3.2 בפרוטוקול). בנוסף, ההליך זה הרבה יותר קשה עם מצעים מצופים איטו: (1) בשל השקיפות של הזכוכית איטו, קשה לראות את הקצה של המים שבו הקצוות של הסרטים צריך להיות מחובר; 2) בגלל פני השטח מצופים איטו היא הרבה יותר קשה מאשר פרוסות הסיליקון המבריקה, הסרטים נוטים לשבור במהלך מעלית ו שברים קטנים יותר בהיקף של כמה חלקים עשויים לצוף, ובכך להרוס את סדר המקטעים.
כל זרימת העבודה היא גם אפשרית ללא מתאם הצילומים נתונים. במקרה זה, של ה-SEM איסוף נתונים, ייתכן שיהיה עליך להתבצע תוך מספר מפגשים. באמצעות עבודות שיקום 3D הראשונית או לפחות הערכה של נתונים ברזולוציה נמוכה או בינונית עשוי להיות נחוץ לזהות מטרות. בנוסף, ניתן להחיל קונבנציונאלי היסטולוגית כתמים על brightfield LM (לא דרישת הצילומים). כמובן, אחרים אפשרויות6,7,8 הם נוגדנים תיוג על המערכים, כפי שהוכח כבר בעיתון הראשונית על18, או גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט (XFPs) או טרום הטבעה תיוג עם שימור פלורסצנטיות במהלך הכנת הדוגמא.
מגבלה כללית של השיטה דנו הוא השימוש של מקטעים של עובי מסוים ואת הדוגמאות דיסקרטית וכתוצאה מכך של הגוף התלת-ממדי: רזולוציה ב- Z רק יכול להיות טוב כמו העובי של הסעיפים מאז ה-SEM אוספת נתונים רק מפני השטח בסעיף (ד epending על האנרגיה האנרגיה העיקרי/הנחיתה שנבחרו). משמעות הדבר היא כי הגוף התלת-ממדי וכתוצאה מכך יש voxels אנאיזוטרופי, למשל., 5 x 5 x 100 ננומטר3 אם 100 ננומטר ומקטעים גודל פיקסל תמונה של 5 nm משמשים. עבור ישויות קטן מאוד בטווח גודל מתחת 1 מיקרומטר, לא ייתכן מספיק לתיאור ultrastructural אמיתי. מגבלה טכנית יותר הוא הדיוק של השלב בשימוש ה-SEM אוטומטיות הדמיה. בגלל זה, יש צורך לבחור רועי גדול יותר המפרטים של דיוק הבמה כדי להבטיח כי הוא עם תמונה של אזור היעד מלא.
לעומת SBF-SEM, שיקרתי-SEM כמו בשיטות הדמיה בלוק-פרצוף, correlative AT יש החיסרון סופית של voxels אנאיזוטרופי, כמפורט לעיל. עם שיקרתי-SEM, איזוטרופיות voxels של 5 x 5 x 5 nm3 ניתן להשיג כאשר תיקון להיסחף נכונה במקום.
פערים האחסון המשוחזרת עקב אובדן חלקים במהלך הכנת מערכי ייתכן גם חשש כי הוא לא נתקל עם SBF-SEM או שיקרתי-ב-SEM. עם סרט טוב ייצוב על ידי דבק, זה בדרך כלל רק עניין עבור המקטע האחרון של סרט: שהוא ניזוק בעת שחרור אותו מן הכי קשה באמצעות את הריס. עם זאת, מניסיוננו, האובדן של מקטע אחד בסעיפים 20 – 50 כל לא להשפיע התמונה רישום.
מצד שני, האפשרות שלאחר כתם מערכים מקנה איתות טוב והחדות עבור הדמיה SEM, אפילו על דגימות בחולשה מחלקמסוים כגון לחץ גבוה קפוא טיפים שורש המוצג כאן. לכן, אין צורך להתפשר אופטימלית שימור ultrastructural על ידי רבים קיבוע כימי והשלבים metallization. כמו כן, שגרתית דגימות למעבדה פתולוגיה עם דרגות ביניים של metallization מספקים נתונים מצוינים10. כזה שיפור חדות לאחר ההטבעה אינה אפשרית עבור SBF-SEM, שיקרתי-SEM באופן כללי. יתר על כן, מאז שיטות אלה הם הרסניים, קרי, לצרוך את הדגימה במהלך ההדמיה, הירארכי הדמיה ב רזולוציות שונות ואתרים או הדמיה חוזר ונשנה בשלבים מאוחרים יותר בזמן בלתי אפשרי. בעקרון, אמצעי אחסון ללא הגבלה, המורכב FOVs גדולים (למשל, עד כמה מילימטרים עבור מוח העכבר כל ב- connectomics) נוצר על ידי תפרים פסיפסים, מספרים עצומים של מקטעים ניתן לרכוש באמצעות AT, בעוד שיקרתי-SEM, FOVs מעבר 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר הם קשים להשגה עם מכשירים שגרתי.
אוטומציה נוספת של AT-זרימת העבודה המתוארת יהיה יתרון מובהק, מאחר השיטות הנ ל SBF-SEM, שיקרתי-SEM לבצע חלוקתה והן הדמיה בתוך מכשיר זהה באופן אוטומטי לחלוטין. קיים סוג אחד של אוטומציה של חלוקתה: ATUMtome12 יכול לייצר ולאסוף אלפי סעיפים, אבל השימוש Kapton סרט כמו מצע עושה כאלה מערכים קשה התמונה הצילומים. על coverslips מצופים איטו המשמש כאן, הדמיה סופר-ברזולוציה אפילו צריך להיות אפשרי. מטרה נוספת, רצוי מאוד לאוטומציה תהיה ההקלטה של אוספים נתונים הצילומים. מצד שני, אוטומציה יכול להיות יקר וכן למעט המחזיק המצע, זרימת העבודה המוצגת כאן (מבחינת חומרה) רק על מכשור ניתן בדרך כלל במתקן שגרתית EM מעבדה או ליבה, שהופך אותו נמוך רמת גישה.

לשחזור כמויות גדולות של רקמות ברזולוציה ultrastructural מספר גישות הדמיה שונות בהתבסס על SEM היה בשימוש1: מקיף הדעת הינם זמינים למשל., SBF-SEM2, שיקרתי-SEM3של מערך טומוגרפיה (ב)4. בזמן עבור פעולת השירות השנייה דגימת החומר נשמר כמערך של מקטעים טורית על מצע, SBF-SEM, שיקרתי-SEM הם שיטות הרסני, עובד על הרחוב דגימה לצרוך אותו במהלך דימות. עקב ההטענה של השרף בעוד SEM, הם גם תלוי מדגם מחלקמסוים חריפה בלוקים5.
מצד שני, זיהוי תאים או מבנים של עניין בתוך דגימת רקמה מסוימים יכולים להרוויח במיוחד אור correlative ומיקרוסקופ אלקטרונים (קלם)6,7,8. באמצעות הצילומים עבור מיקוד מונע את היישום של כמויות גדולות של מתכת כבדה מאז זה להרוות את האות של קרינה פלואורסצנטית9. לקבלת דוגמאות מחלקמסוים מעט, רק כאלה AT היא שיטת הבחירה מכיוון במערכים ייתכן שלאחר ויטראז'ים עם מטאל בקלות לאחר LM הדמיה. יתר על כן, כמעט כל סוג הדגימה עשוי לשמש AT, אפילו שגרתית דגימות של הפתולוג אוצר החזה10.
יתרון גדול נוסף של AT הוא הפוטנציאל הירארכי11 או הדמיה ברזולוציה מרובה12: זה לא הכרחי כדי התמונה הכל ברזולוציה, כמו מטרות שייתכן שייבחר מודאליות שונים (למשל, הצילומים) או ב תמונות SEM ברזולוציה נמוכה. הדמיה רק את האזורים מעניין של אוכלוסיה רקמות או תא ברזולוציה חוסכת שטח אחסון נתונים דיגיטליים ומייצרת קטנים יותר ערכות נתונים תמונה, אשר קל יותר להתמודד. כאן, שזרימת העבודה AT הוכח באמצעות דגימת די חלש מחלקמסוים: בלחץ גבוה קפוא שורשי צמחים (תודרנית לבנה) המוטבעות שרף הידרופילית.
כיצד מערכי מוכן, צבעונית, עם תמונה הצילומים והן SEM, וכיצד אוספי תמונות רשומים מוסברים. כמו כן, כיצד ניתן להשתמש על שחזור תלת-ממד של אמצעי האחסון הצילומים כדי לבחור תאים ספציפיים עבור הדמיה SEM ברזולוציה הננומטרי מודגם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

פילוח תאים ספציפיים ברזולוציה ultrastructural בתוך אוכלוסיה לתא מעורב או רקמה יכולה להיות מושגת על ידי הדמיה היררכי באמצעות שילוב של אור ואלקטרון. דוגמאות נעוץ שרף למחלקה לתוך מערכי המורכב סרטים של מאות סעיפים ודק במיוחד, שהופקדו על חתיכות של פרוסות סיליקון או coverslips מצופה conductively. מערכים הם עם תמונה ברזולוציה נמוכה באמצעות הצרכן הדיגיטלי החכם מצלמה, בסיוע מיקרוסקופ אור (LM) עבור סקירה מהירה שטח גדול, או מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב (קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ אור (הצילומים)) לאחר תיוג עם fluorophores. לאחר פוסט-צביעת מתכות כבדות, מערכים הם צילמו במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). הבחירה של מטרות אפשרי שחזורים תלת-ממד שנוצר על ידי הצילומים או שחזורים תלת-ממד מסיבים של אוספי תמונות SEM ברזולוציה ביניים אם אין סמני פלורסנט זמינים. ניתוח ultrastructural, יעדים נבחרים נרשמים לבסוף בעוד SEM ברזולוציה (כמה ננומטר פיקסלים בתמונה). כלי טיפול רצועת הכלים יכולה שרשומים על כל ultramicrotome הוא הפגין. היא מסייעת עם מערך ייצור המצע להסרת מהסירה הסכין אופטים. נדון פלטפורמת תוכנה המאפשרת הדמיה אוטומטית של מערכים ב- SEM. לעומת שיטות אחרות ליצירת נפח גדול EM נתונים, כגון לחסום טורי-פרצוף SEM (SBF-SEM) או יון ממוקדת קרן SEM (שיקרתי-SEM), גישה זו יש שני יתרונות חשובים: (1) חוק המדגם שרף-מוטבע, אם כי בגרסה פרוסים-up. זה יכול להיות מוכתם בדרכים שונות, עם תמונה עם רזולוציות שונות. (2) כפי הסעיפים יכול להיות מוכתם פוסט, אין צורך להשתמש דגימות שהוכתמו בלוק בחוזקה מתכות כבדות כדי להציג את הניגודיות עבור הדמיה SEM או למסור את הרקמה בלוקים מוליך. זה הופך את השיטה החלים על מגוון רחב של חומרים, השאלות הביולוגיות. חומרים במיוחד כנסיעה למשל, בנקים ביופסיה, מעבדות פתולוגיות, יכול להיות מוטבע באופן ישיר משוחזר ב- 3D.

זרימת העבודה המתוארת כאן (איור 1) מתחיל עם מדגם מוטבע בתוך גוש שרף. במהלך הכנת המדגם, צריך להכיר כמה מתכות כבדות לתוך הרקמה, אבל זה לא הכרחי כדי להשתמש בפרוטוקולים ממוטב לציפוי חזק למדי. איור 1A מציג שורש הצמח (אכלתי) בלוק שהוכתמו כמקובל עם 1% OsO4 ו- 1% uranyl אצטט, בעוד לשורש תודרנית איור 1B הוא רק חלש metalized באמצעות אצטט uranyl 0.5%. סוג הדגימה השנייה היא המתאימה ביותר עבור גישות correlative כמו מתכות כבדות מסוימים נוטים להרוות זריחה. עם בעל המצע ייעודי (איור 2), מערכים של כמה מאות מקטעים יכול להיות מיוצר (איור 1C). לאחר תיוג פלורסנט, מערכים כאלה עם תמונה ב הצילומים שדה רחב סטנדרטיים (איור 1D), ולאחר מכן צבעונית עם פתרונות מתכת כבדה, עם תמונה בעוד SEM ברזולוציות שונות (איור 1E–G).
כלים חשובים לדור לשחזור של מערכים, במיוחד כאשר הצבת מספר סרטים מן הסירה האזמל הקטן של סכין על גבי מצע, הינם בעל המצע (איור 2 א, אישית מעוצבת במעבדה של המחברים) יהלום ג'מבו הסכין עם סירה גדול דיו כדי להתאים שקופיות מיקרוסקופ (איור 2B). מניסקוס שטוח, המאפשר התבוננות טובה של הסרטים, הכרחי, יכולה להיות מושגת על ידי פלזמה ניקוי של המצע: droplet קטן של מים מזוקקים לא יוצרות מבנה דמוי עדשה על המצע כמו דמות 2C (המצע ללא טיפול). אבל סרט דק (איור דו-ממדי, המצע פלזמה מופעל). בתנאים אלה, סרטים המצורפת החלק היבש של coverslip מצופים איטו הן בקלות דמיינו (איור 2E), ניתן להקליט ולצפות במעשיהם מבוקרים במהלך הרמת-out של המצע מן המים.
לדוגמה, מערכים מוכתם propidium יודיד לתייג לחומות תא צמח היו עם תמונה עם שדה רחב סטנדרטיים הצילומים (איור 3 א). מאז הסעיפים הם רק 100 ננומטר עבה, אפילו יתר מכתים כמוצג כאן מציג טשטוש מעט. לאחר ההרשמה, שני התאים סגורים לחלוטין באמצעי האחסון המשוחזרת נבחרו מתוך אוסף תמונות (איור 3B) עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ב- 3D (ראה גם משלימה סרט S1). בעקבות נוספים מכתים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט, מערכי היו עם תמונה ב- SEM. איור 3 ג' מציג סקירה, הקליט עם 60 ננומטר פיקסלים בתמונה; הכיכר כהה במרכז התמונה מציין את המיקום שבו הפונקציות פוקוס אוטומטי הוצאו להורג, המינון נוספים הובילו זיהום קלה. מתאים ROIs בסעיפים האלה טורי (פרוסות 51 עד 248 פרוסות 435 סה כ) המכיל תאי היעד שני שנבחרו באוסף הצילומים נרשמו אז עם גודל פיקסל תמונה 5 nm (דמות תלת-ממד; ראה גם משלימה סרט S2).
הדמיה הירארכי אוטומטיות של המערכים בעוד SEM המתוארים כאן נעשה עם הפתרון פלטפורמת חומרה ותוכנה ZEISS אטלס 5. ראשית, סקירה כללית של המערך כולו נוצר באמצעות גלאי SE, גדולים מאוד (1,000 ננומטר) תמונה פיקסלים וזמן להתעכב נמוך מאוד (איור 4A). רועי חלוקה לרמות בלבד הרקמה היה דגש על החלק הראשון, הם מופצים כל המקטעים של המערך. זו מוגדרת בסעיף הוקלט אז עם 60 ננומטר פיקסלים בתמונה באמצעות זמן להתעכב זמן רב יותר (איור 4B). לבסוף, מערכת האתר, המכיל תאי היעד שני פלוס אחד "שכבה" של תאים המקיפים אותם כדי להסביר במה דיוקים, הוקם עם הפרמטרים הבאים: גלאי ESB (Backscatter סלקטיבי אנרגיה), התמונה nm 5 פיקסלים, ארוך מאוד (40 µs) להתעכב זמן ( איור 4C). התקרבות לתמונה כזו מציגה פרטים subcellular (איור 4D) כגון וקואלות (V), המיטוכונדריה (ז), גרעין (N) (חיצים) רשתית תוך-פלזמית. ראה גם משלימה סרט S3 עבור התקרבות מתוך ראייה כוללת של המערך כולו עד הפרט subcellular של אחד תא היעד.
המערך המוצגת כאן (סעיפים 200) פלוס נוסף אחד סעיפים 250 לקח כ- 8 שעות כדי לייצר, לילה אחד כתם של LM ולאחר יום אחד להקליט (ידנית) בסוף הצילומים. פוסט-צביעת לוקח בערך 1-2 שעות בסך הכל, בהתאם למספר מערכים בודדים. עבור הקלטה SEM, נדרשים כמה שעות כדי להגדיר הפעלה אטלס, הקלטה אוטומטית היה h 3-4 פתרון ביניים (60 ננומטר גודל פיקסל) מקטע ערכת (סעיפים 200, 450 x 200 מיקרומטר2), כ- 5 ימים עבור ברזולוציה גבוהה (5 nm pixel גודל) רועי המכיל תאי היעד שני (סעיפים 200, 55 x 30 מיקרומטר2). שימו לב כי בשל תכולת המתכת נמוכה של הדוגמה המוצג כאן, מהירות סריקה מאוד איטית חייבת לשמש כדי להגיע של זיהוי האות לרעש טוב, ומזה משתמע (עבור גלאי זמין כרגע) זמן להתעכב של 40 µs עבור רועי ברזולוציה גבוהה.
קיימים מספר שלבים בזרימת העבודה כולו נוטה החסרונות: באופן אידיאלי סרטים צריך להיות פחות או יותר ישר, ולהניחו בסדר הנכון (איור 5A). עם זאת, בנט (איור 5B), עקומים (איור 5D) או סרטים שבור אפילו לעיתים קרובות מיוצרים. זה יכול לגרום עקב חיתוך שגוי (המובילים וקצוות נגרר לא בדיוק מקביל), או דבק יישומית שאינו אחיד, אלא גם דוגמה אסימטרי או הסתנן לצר. בעייתי במיוחד הן דוגמאות המכיל רכיבים רך וקשה מאוד. הרכיבים האחרון עשוי להיות קשה לחדור כמו קיר התא של שורשי הצמח המוצגת כאן (איור 5C). במקרה כזה, הקפלים (חץ) יכול להיגרם בקלות על ידי דחיסה משתנים ורוגע במהלך חלוקתה. אוטומטיות הדמיה בעוד SEM, סרטים מעוקל הם לא בעיה גדולה, מאז ניתן לסובב את ROIs כדי להכיל את העקמומיות של רצועת הכלים.
עוד צעד קריטי בפרוטוקול מכתימה: כביסה לקוי יכול להוביל משקעים מעל המקטע (איור 5E, F), במקרה הגרוע ביותר, לכסות את האזור המעניין ביותר (עיגול על אחד של תאי היעד שני ב- 5F איור). כמו כן, אבק (איור 5D, פיזור אור חזק חלקיקים) הציגו לתוך הספינה סכין, למשל, עם הספק המצע מלוכלך, עלול לגרום לבעיות חמורות: בסוף הצילומים, אבק יכול להיות מאוד פלורסנט (cf. כמה פרוסות משלימה את הסרט S1) במידה כזו מספר אלגוריתמים רישום שלא יפעל. הפונקציה "יישר" TrakEM17 . עם זאת, יכול להתמודד עם כזה ערימות כפי שמתואר ב S1 הסרט משלים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> איור 1: זרימת עבודה עבור ההדמיה הירארכי correlative. החל מ מדגם מוטבע בתוך גוש שרף (A, מדגם מחלקמסוים חריפה), הדוגמה הראשונה החתוך (B, בחולשה מחלקמסוים לדוגמה), ואז מערכים המורכב סרטים מספר סעיפים טורי (C), כאן מונחת מצופים איטו coverslip, מיוצרים בטכניקה של ultramicrotome. לאחר צביעת עם הפלורסנט, ערימות של תמונות נרשמות על הצילומים שדה רחב (D). לאחר עוד יותר מכתימה עיגול עם מטאל זלץ, ערימות הם צילמו בעוד SEM (E–G) ברזולוציות שונות (מידות פיקסלים בתמונה). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> איור 2: כלים עבור הכנת מערכי. המצע מחזיק התכנסו from micromanipulators עם שבע צירי תנועה המצורפת ultramicrotome רגיל (א): הברגים, מודגש עם עיגולים, הן עבור אנכי (1) ו- (2) תנועה אופקית עבור הטיית (3) של המוביל המצע . סכין יהלום ג'מבו הסירה ענקיות כדי להתאים מצעים גדול (חץ), כאן עם פיסת הסיליקון מופעל פלזמה וופל רכוב על גבי נשא אלומיניום בגודל שקופית (B). µL 20, טיפות מים מזוקקים להציב על גבי מצע וופל של הסיליקון אינו מטופל (C) או על מצע מופעל פלזמה (D). ארבעה סרטים צפה סירה הסכין, המצורפת של coverslip מצופים איטו מאת הקצוות שלהם נמוכה יותר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> איור 3: המתאם של LM הנתונים עם נתוני SEM. בתצפיות (, ג) עם התאים היעד (B, D) הקליט עם הצילומים (, B) ו- SEM (C, D). (B) היא תוכנת זום, הנתונים המקוריים נרשמו עם עדשה המטרה X 40 על שבב המצלמה פיקסל 1,388 x 1,040, (ג) הוא הקליט עם 60 ננומטר פיקסל, וגודל תמונה (D) עם 5 nm pixel גודל תמונה, הממחישות את האמיתית לודיג רזולוציה ב- SEM <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> איור 4: היררכית הדמיה בעוד SEM באמצעות ZEISS אטלס 5 ב סקירה של מערך הקליטה עם 1000 פיקסלים בתמונה של nm, באמצעות גלאי SE (A). הסעיף מגדיר עם רועי הניח על רקמות בכל מקטע והקליט עם פיקסלים בתמונה 60 ננומטר (B). אתר מגדיר עם רועי טורי מניחים על התאים היעד והקליט עם פיקסלים בתמונה 5 nm (C). בעת התקרבות אל כאלה תמונות ברזולוציה גבוהה (D), תאי ממברנה תאיים כגון וקואלות (V), גרעין (N), המיטוכונדריה (ז) ו- (חיצים) רשתית תוך-פלזמית הופכים לגלויים. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> איור 5: בעיות טיפוסיות. 1. הנובעים מתהליך אופטים: סרטים על coverslips מצופים איטו דחיסה אידיאלי ישר (A), אבל לא סדירות במהלך חלוקתה עלול לגרום בנט (B) או מעוקל סרטים (D), או אפילו קיפולים (C). 2. הנגרמת על ידי טיפול המצע וסרטים במים, למשלבמהלך חלוקתה, צביעת: אור פיזור חלקיקי על המצע (D), רים של טיפות על סעיף (עיגול ב- E), או לכלוך מרוח החוצה רקמות עקב לקוי כביסה לאחר צביעת (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
S1 הסרט משלים: אוסף תמונות הצילומים. תמונות 435 מיושר ב פיג'י16 באמצעות TrakEM17 ונשמר כקובץ סרט (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה את הסרט S2: אוסף תמונות SEM. תמונות 210 המיושר פיג'י16 באמצעות TrakEM17. המחסנית המקורית (300 תמונות) של ערכת נתונים זו היה 15 ג'יגה-בתים. לצמצם את המחסנית של 3.3 ג'יגה-בתים (לאחר יישור וחיתוך כדי רק השניים היעד תאים), זה המידה ב- x ו y לפי פקטור של 0.2 באמצעות פיג'י ולאחר מכן לשמור בתור סרט .avi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
S3 הסרט משלים: התקרבות עם רמות רזולוציה אחרת ב- SEM. הסרט יצר וייצא מתוך התוכנה אטלס 5 בתבנית .mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...