Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
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この仕事は、教育・研究、プロジェクト MorphiQuant 3 D ドイツ連邦環境省から補助金 FKZ 13GW0044 によって支えられました。テクニカル サポートありがとうカロリン バーテルス。

<ol>
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キットには、基板ホルダーの機能モデルの供給のための Boeckeler メンツによる払い戻しを受けています。マレーネ Thaler はツァイス顕微鏡 gmbh 社は、この資料に記載されている顕微鏡システムのメーカーの従業員です。さらに、ツァイスはツァイス アトラス SEM と FIB SEM の楽器のための大面積、3 D イメージング アプリケーションの広い範囲のソリューション パッケージなど特定のソリューションを提供しています。他のすべての著者が明らかにする何もあります。

マルチ モーダル階層が組織内の特定のセルを対象にワークフローを示した: 連続切片、特注基板ホルダーを用いた導電性基板上に配置されたアレイに樹脂包埋標本をスライスします。ラベリング、fluorophore および FLM で画像処理、再生ボリュームが標的細胞を選択するため使用されます。後にコントラストを紹介する重金属ラウンド追加染色, 自動化されたソフトウェア プラットフォームを使用して SEM でナノスケールの分解能でいくつかの百のセクションこれらのターゲットが作成されます。
いくつかの長いリボンで密集配列を生産するには、ここで説明したような基板ホルダーが必要です。熟練した、患者の人は、いくつかのリボンを付けるナイフ ボート半浸漬シリコン基板と基板上に座っている、リボンまで徐々 に水のレベルを下げることによって配列を取得することがあります。しかし、私たちの経験、基板ナイフ ボート (cf. 注プロトコルに 1.3.2 で) の任意の部分に触れているときに形成を粉砕する傾向があります。さらに、この手順は難しく ito 基板: (1) 伊藤ガラスの透明性のためリボンの両端が添付される; が、水のエッジを参照してくださいすることは困難です。(2) と ito の表面は非常に洗練されたシリコンウエハよりはるかにざらざら、リボン リフト アウトいくつかのセクションから成る小さな断片が浮かぶかもしれないしセクションの順序をこのように破壊の間に壊れる傾向にあります。
ワークフロー全体 FLM データに相関することがなく可能です。この場合、いくつかのセッションで実行する、SEM でのデータ収集があります。初期の 3 D 再構成または少なくとも低または中程度の解像度のデータの評価のターゲットを識別する必要があります。また、明視野 LM の従来の組織学的汚れ、(要求しない FLM) を適用する可能性があります。もちろん、その他オプション6,7,8 18での初期の論文ですでに実証として、アレイにラベルまたは遺伝子蛍光タンパク質 (XFPs) をエンコードまたはラベルを埋め込み済み抗体試料中の蛍光の温存。
議論法の一般的な制限は、特定の厚さのセクション、3 D ボリュームの結果として得られる離散サンプリングの使用: SEM セクション表面 (d からのみデータを収集するために、Z の解像度をセクションの厚さと同じくらい良いのみすることができます選択したプライマリ エネルギー/着陸エネルギー epending)。つまり、結果として得られる 3D ボリュームが例えば異方性ボクセル。、100 nm3場合 100 x 5 x 5 nm のセクションと 5 の画像ピクセル サイズ nm を使用。1 μ m 以下のサイズの範囲で非常に小さなエンティティは、これは真の微細構造の説明のために十分はない可能性があります。技術的な制限は、自動化イメージング、SEM で使用段階の精度です。このため、完全なターゲット領域がイメージ化されることを保証するためステージ精度の仕様よりも大きな ROI を選択する必要は。
相関 AT に比べて SBF SEM と FIB SEM ブロック顔画像処理方法として、上記の異方性ボクセルの決定的な欠点があります。FIB-SEM、適切なドリフト補正されている場合、5 nm3 x 5 x 5 の等方性ボクセルを取得できます。
配列の準備中のセクションの損失による再建された量のギャップは、SBF SEM や FIB SEM. が検出されない懸念もあります。接着剤によって、良いリボン安定化と、通常リボンの最後のセクションの唯一の問題はある: まつげを使用してナイフエッジから離すときは破損している可能性があります。しかし、我々 の経験ですべての 20-50 のセクションで 1 つのセクションの損失は画像の位置合わせに影響しません。
その一方で、後の配列を染色する可能性使うと良好な信号と SEM 用もここに示すルート ヒントを冷凍高圧など弱くメタライズド サンプルのコントラスト。したがって、多数の化学固定法と配線の手順によって最適な微細構造保全を妥協する必要はありません。また、金属の中間程度で病理学研究室からルーチンのサンプルは、優れたデータ10を提供します。このようなポスト埋め込みコントラスト強調は一般的に SBF SEM と FIB SEM のため不可能です。さらに、これらのメソッドは破壊的なので、すなわちイメージング、異なる解像度でサイト画像階層または時間の後で、繰り返されるイメージング中にサンプルを消費することはできません。原則として、大きな FOVs (例えば、コネクトミクス全体のマウスの頭脳の複数のミリメートルまで) から成る、無制限のボリューム作成モザイクをステッチで、AT 中 100 μ x 100 μ m を超えて FOVs FIB SEM によるセクションの膨大な数を得ることができます。ルーチンの楽器と達成するために困難です。
説明でワークフローのさらなる自動化 SBF SEM と FIB SEM の上記の方法を実行両方区分および完全に自動化された方法で同じ楽器内イメージングので決定的な利点であります。断面のオートメーションの 1 つの種類が存在する:、ATUMtome12を生成し、セクションの何千もの収集が、カプトン テープの使用基板はこのような配列、FLM の画像に困難。ここで使用される ito の coverslips にも超解像イメージングが可能なはず。自動化のためのさらに、非常に望ましいターゲットを FLM データ スタックの記録となります。その一方で、オートメーションが高くなり、基板ホルダーを除くここに示すワークフローに依存している (ハードウェア) の面でのみ計測ルーチン EM 研究所または中核施設、ロウで通常利用可能なアクセスのレベルします。

大量の超微細構造の解像度で組織を再構築するため SEM に基づくさまざまなイメージング手法の数は、使用される1をされている: 包括的なレビューは利用できる例えばSBF SEM2、FIB SEM3、および配列のために、。(AT)4断層撮影。後者の方法のサンプル素材は、基板上のシリアル セクションの配列として保存されて、しながら SBF SEM FIB SEM は、破壊的な方法は、サンプル ブロックに取り組んでいるイメージング中にかかります。SEM で樹脂の充電のため強くメタライズド サンプル ブロック5にも依存します。
その一方で、特定の細胞または組織サンプル内の対象の構造体を識別すると、相関光と電子顕微鏡 (クレム)6,7,8から特に利益することができます。これは蛍光信号9を消すだろうから重金属の大量のアプリケーションを排除する対象 FLM を使用します。このような少しメタライズド サンプルのみ AT が選択の方法です配列は、LM のイメージング後重金属染色後簡単に場合がありますので。また、AT のほぼすべてのサンプルの型を使用する、日常も採取病理学者の宝箱10。
AT のもう一つの大きな利点は、階層11または多重解像度画像12の可能性: 高解像度で、すべてのイメージを必要はありません (例えばFLM) 異なるモダリティや、目標を選択可能性がありますように、低解像度の SEM 画像。高解像度組織またはセル人口の興味深い領域のみを画像デジタル データ ストレージ領域を節約し、は扱いやすい、小型のイメージ データ セットが生成されます。ここでは、AT ワークフローはむしろ弱くメタライズド サンプルを使用して示されて: 親水性の樹脂に埋め込まれた高圧冷凍植物の根 (シロイヌナズナ)。
配列を準備、ステンド グラス、FLM の SEM、イメージ画像のスタックは、登録方法などを説明しています。また、FLM ボリュームの 3 D 復元を使用して、ナノスケールの分解能 SEM イメージングのための特定のセルを選択する方法を示しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

光と電子顕微鏡の組み合わせを使用して階層的なイメージングによる混合細胞またはティッシュ内の微細構造の解像度で特定のセルをターゲットを実現できます。樹脂に埋め込まれたサンプルは超薄切片の何百ものリボンで構成される配列に分割、シリコンウエハや伝導コーティング coverslips の部分に堆積しました。配列は、fluorophores が付いている分類後広い場蛍光顕微鏡 (蛍光光学顕微鏡 (FLM)) または光学顕微鏡 (LM) 急速な大面積の概要については、スマート フォンのカメラのようなデジタル家電を使用して低解像度で作成されます。重金属で染色後、走査型電子顕微鏡 (SEM) の配列が作成されます。ターゲットの選定は、FLM によって生成された 3 D 再構成や蛍光マーカーが利用できない場合、中間解像度で SEM 画像のスタックから作られた 3 D 再構成から可能です。微細構造の解析に選択したターゲットは最終的にで高分解能 SEM に記録されます (数ナノメートル画像ピクセル)。どんなウルトラミクロトームに後付けすることができますリボン処理ツールが示されています。これのアレイ生産および断面のナイフ ボートから基質除去に役立ちます。SEM で配列の自動イメージングを可能にするソフトウェアプラット フォームを説明しています。シリアル ブロック面 SEM (SBF SEM) または集束イオンビーム (FIB SEM)、SEM などの EM の大きなボリューム データを生成する他の方法と比べてこのアプローチには 2 つの主要な利点: (1) スライスしたアップ バージョンではいえ、樹脂包埋試料は保存されています。それはさまざまな方法で染色し、解像度の異なるイメージを作成できます。(2) セクションが後に汚すことができると、重金属と強くブロック染色サンプルを使用して SEM 画像のコントラストを紹介または導電性組織ブロックをレンダリングする必要はありません。これにより、メソッドがさまざまな材料と生物学的質問に適用されます。特にプレフィックス付きの材料など、銀行生検と病理研究所から直接埋め込みでき 3 D で再構築します。

ワークフローは、レジン ブロックに埋め込まれているサンプル (図 1) 開始を紹介します。サンプル準備の間にいくつかの重金属を組織に導入する必要がありますが、それはむしろ強い金属化用に最適化されたプロトコルを使用する必要はありません。図 1 aは、(クレス) ブロック - 従来で染色 1% OsO4と 1% 酢酸ウラン、図 1 bでのシロイヌナズナ根が弱だけ中にメタライズド 0.5% 酢酸ウラニルを扱う植物の根を示しています。後者のサンプルの種類は、蛍光を抑制する傾向があるいくつかの重金属相関アプローチに最適です。専用基板ホルダー (図 2)、いくつかの百セクションの配列することができます (図 1) を生成します。蛍光標識後そのような配列標準ワイド フィールド FLM (図 1) のイメージを作成し、重金属ソリューションで染色、解像度が異なる (図 1E-G) SEM のイメージします。
再現性の高い世代のアレイのための重要なツール、基板上にミクロトームのナイフの船からいくつかのリボンを配置するときに特に、基板ホルダー (図 2 a、筆者らの研究室ではカスタム設計された) とジャンボ ダイヤモンド顕微鏡スライド (図 2 b) に対応するのに十分な大きさのボートを持つナイフ。フラット メニスカス、リボンの良い観測を許可する必要があるし、基板のプラズマ クリーニングによって達成することができます: 蒸留水の小さな液滴は、図 2 (未処理基板) のように基板上のレンズのような構造を形成してはいけません(図 2 D、プラズマ活性化基板) 薄膜が。Ito coverslip の乾燥部分に接続されているリボンが簡単にこれらの条件の下で (図 2 e) を可視化しを観察、水から基板のリフト アウト時に制御します。
例として、FLM (図 3 a) 標準的な広い視野を持つアレイ propidium ヨウ化植物細胞壁にラベルを付けるとステンド グラスをイメージしました。セクションのみ 100 nm の厚さでも、過剰染色ここで示すように、少しぼかしを紹介します。登録後、再建されたボリュームに完全に囲まれている 2 つのセルが 3 D で高分解能イメージングのための画像のスタック (図 3 b) から選ばれた (また見なさい補足ムービー S1)。次の追加染色ウラニルのアセテートおよび鉛のクエン酸と、配列をイメージしました、SEM の3 C を図60 nm イメージ ピクセルで記録、概要が表示されます画像の中心の暗い正方形は、オート フォーカス機能を実行すると、追加投与量は、わずかな汚染につながった位置を示します。これらの連続切片 (435 スライスの 51 に 248 をスライス、合計で) に、適切な 5 nm 画像ピクセル サイズで記録された FLM スタックで選択した 2 つのターゲット細胞を含む (図 3 D;映画 S2 の補足も参照してください。)。
ここで説明した SEM 内のアレイの自動化された階層的なイメージングは、ソフトウェア/ハードウェア プラットフォーム ソリューション ツァイス アトラス 5 で行われました。まず、アレイ全体の概要と SE 検出器を使用して作成された非常に大きな (1,000 nm) 画像のピクセルと非常に低い滞留時間 (図 4 a)。組織のみをまとめた投資収益率は最初の部分に配置され、配列のすべての他のセクションに反映されます。このセクションの設定は 60 nm イメージ ピクセル (図 4 b) 長い滞留時間を使用して記録されます。最後に、2 つのターゲット細胞プラスワン ステージの不正確さを考慮して細胞を周囲の「層」を含むサイト セットは、次のパラメーターがセットアップされました: ESB (後方散乱エネルギー選択) 検出器、5 nm イメージ ピクセル、非常に長い (40 μ s) に住む (の時図 4)。このような画像をズームイン空胞 (V)、(M) のミトコンドリア、核 (N) 小胞体 (矢印) など細胞レベル下の詳細 (図 4) を示しています。1 つの標的細胞の細胞内の細部に全体の配列の概要からズームインの補足映画 S3も参照してください。
(200 のセクション) を示す配列に加えて、追加生産する約 8 h を取った 250 セクションの 1 つ、FLM で (手動で) 記録する LM、および 1 日のために 1 泊。合計では、個々 のアレイの数に応じて約 1-2 時間を取る後染色します。アトラスの実行を設定する必要が SEM の記録、数時間と自動記録された h 3-4、高分解能 (5 nm ピクセル サイズ) の約 5 日間中間解像度 (60 nm ピクセル サイズ) セクション セット (200 のセクション、450 x 200 μ m2) 投資収益率(200 のセクション、55 x 30 μ m2) の 2 つのターゲット細胞を含みます。ここで示したサンプルの低金属含有量が、ため暗黙的に指定 (現在利用可能な検出器) 40 μ s のドウェル時間高解像度の投資収益率の良好な信号対雑音検出を到達するために非常に遅いスキャン速度が持っていた注意してください。
落とし穴になりやすい全体のワークフローにいくつかの手順があります: 理想的にはリボンがもっとまたはより少なくまっすぐと (図 5 a) 正しい順序で配置をする必要があります。ただし、ベント (図 5 b)、曲線 (図 5)、または壊れたリボンがしばしば生産されます。不適切なトリミング (リーディング エッジとトレーリング エッジない正確に平行)、または非一様に適用接着剤による非対称または不均一浸透したサンプルからも可能性があります。特に面倒なサンプルは、非常にハードとソフトの両方のコンポーネントを含みます。後者のコンポーネント (図 5) を示す植物の根の細胞壁などに侵入することは困難があります。その場合は、ひだ (矢印) はすることができます簡単に可変圧縮と区分の間に弛緩によって引き起こされます。自動イメージング、SEM、Roi はリボンの曲率に合わせて回転できるので曲線リボンは大きな問題ありません。
プロトコルの別の重要なステップを染色: 不十分な洗浄することができますセクション (図 5 e, F) の残基につながるし、最悪の場合 (図 5 階で 2 つのターゲットのセルの 1 つ上の円) の最も興味深い領域をカバーします。また、塵 (図 5、光強散乱粒子)、例えば、ナイフ ボートに汚い基板キャリアで導入は、深刻な問題を引き起こす可能性が: FLM では、ほこりを高輝度にすることができます (cf.補足的な映画のいくつかのスライスS1) いくつか登録アルゴリズムが機能しないそのような程度。ただし、TrakEM17 「整列」機能は、補足ムービー S1に示すようこのようなスタックを処理できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> 図 1: 相関の階層的なイメージングのためのワークフロー 。樹脂ブロック (A、強くメタライズド サンプル) に埋め込まれたサンプルから始まって、サンプルを最初トリミング (B、弱くメタライズド サンプル) して、配列に配置連続切片 (C) のいくつかのリボンで構成され、ここで、Ito coverslip、ウルトラミクロトームを使用して生成されます。蛍光色素で染色後画像のスタックは、広視野 FLM (D) に記録されます。塩さらに重金属のラウンドを染色後スタックが異なる解像度 (イメージ ピクセル サイズ) で SEM (電子-G) で作成されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> 図 2: 配列の準備のためのツール。基板ホルダーは標準ウルトラミクロトーム (A) に接続されている動きの 7 軸マニピュレーターから組み立て: 円で強調表示されます、ネジが上下 (1) と水平方向の動き (2) および (3) 基板のキャリアの傾斜.プラズマ活性化ウェーハ マウント スライド サイズのアルミ キャリア (B) の部分でここ (矢印) の大型基板に対応する大型船とジャンボ ダイヤモンド ナイフ。20 μ L の滴蒸留水は、未処理のシリコン ウエハー基板 (C) または (D) プラズマ活性化基板上に配置されます。4 リボンの下の端、ito coverslip に接続されたナイフ ボートに浮かんでいます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> 図 3: LM データと SEM データの相関します。FLM (A, B) と (A, C) の概要と標的細胞 (B、 D) 記録と SEM (C, D)。ソフトウェア ズームであり、元のデータが真実を示す 5 nm イメージ ピクセル サイズで 60 nm イメージ ピクセル サイズ、および (D) と (C) を記録しながらの 1,388 × 1,040 ピクセル カメラ チップの 40 倍の対物レンズで記録された (B)SEM での解像度の増加<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> 図 4: ツァイス アトラス 5 でを使用して SEM でイメージング階層1,000 nm 画素 SE 検出器 (A) を使用して、配列の概要を記録しました。セクションはすべてのセクションで組織に配置され、60 nm イメージ ピクセル (B) と記録の ROI を設定します。サイトを標的細胞に置かれ、5 nm イメージ ピクセル (C) で記録されたシリアルの ROI を設定します。このような高解像度画像 (D) にズームすると、液胞 (V)、(N) の核、ミトコンドリア (M) 小胞体 (矢印) などの細胞内膜コンパートメントが表示されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> 図 5: 典型的な問題。1. セクショニング プロセスに起因: 断面中に ito coverslips は理想的なストレート (A) ですが、不規則な圧縮にリボンがもひだ (C) または曲線リボン (D)、ベント (B) を引き起こす可能性があります。2. 断面と染色中と水、例えば、リボンの基板の処理によって引き起こされる: 散乱粒子を基板 (D)、セクション ( e円)、または汚れの液滴の縁に不十分なため組織にまみれて(F) を染色後の洗浄。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ムービー S1: FLM 画像のスタックします。435 画像はフィジー16 TrakEM17を使用して整列し、動画ファイル (.avi) として保存されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足映画 S2: SEM 画像のスタックします。210 のイメージは、フィジー16 TrakEM17を使用して整列されます。このデータ セットの元のスタック (300 画像) は、15 GB でした。それは x でスケーリングされた (後で配置および 2 つのターゲット細胞のみにトリミング) 3.3 GB からスタックを小型化して 0.2 倍 y フィジーを使用し、その .avi ムービーとして保存します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足映画 S3: SEM で解像度の異なるレベルを持つズーム映画に作成され、.mp4 形式でアトラス 5 ソフトウェアからエクスポートします。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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