Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
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이 작품은 교육과 연구, 프로젝트 MorphiQuant-3 차원에 대 한 독일 연방 내각에서 그랜트 FKZ 13GW0044에 의해 지원 되었다. 기술 지원에 감사 Carolin Bartels 하 고.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. 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J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. 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키트는 기판 홀더의 기능 모델의 공급에 대 한 Boeckeler 계기에 의해 환급 받았다. 마 탈 러 ZEISS 현미경 GmbH,이 문서에 언급 된 현미경 시스템의 제조 업체의 직원입니다. 또한, ZEISS ZEISS 아틀라스 솔루션 패키지 다양 한 현미경과 거짓말-sem의 악기에 대 한 큰 영역, 3D 이미징 응용 프로그램에 대 한 특정 솔루션을 제공합니다. 다른 모든 저자를 사용 없다 공개 수 있습니다.

대상 멀티 모달 계층에 의해 조직 내에서 특정 셀에 대 한 워크플로 시연 했다: 수 지에 포함 된 샘플 사용자 정의 설계 기판 소유자를 사용 하 여 전도성 기판에 배치 되는 직렬 섹션의 배열로 나누기입니다. fluorophore로 후는 FLM에서 이미징, 재건된 볼륨 대상 셀을 선택 하는 데 사용 됩니다. 후 추가 얼룩 대비 소개 중 금속 라운드, 이러한 목표는 SEM는 자동화 된 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 나노 스케일 해상도에서 몇 백 섹션에 몇 군데는.
생산 몇 가지 긴 리본을 조밀 하 게 포장된 배열, 기판 홀더 여기에 설명 된 것과 비슷한가 필요 합니다. 유능 하 고 환자 사람 연결 하 여러 리본 실리콘 기판, 반 칼 보트에 열 중 하 고 리본 기판에 앉아있을 때까지 점차적으로 수 위를 낮추는 방법으로 배열을 검색할 수 있습니다. 그러나,에 있는 우리의 경험, 기판은 칼 보트 (1.3.2 프로토콜에서에서 참조 참고)의 어떤 부분을 만질 때 형성을 무 너 뜨 리는 경향이 있다. 또한,이 절차는 훨씬 더 어려운 ITO 코팅 기판: (1) 때문에 이토 유리의 투명도, 그것 보고 어렵습니다 물의 가장자리 리본 끝; 첨부 해야 (2) ITO 코팅 표면 고광택된 실리콘 웨이퍼 보다 훨씬 거칠어 있기 때문에, 리본 리프트- 작은 조각 몇 가지 섹션으로 구성 된 플 로트 수 있습니다, 따라서 섹션의 순서를 파괴 하는 동안 휴식 하는 경향이.
전체 워크플로 FLM 데이터에 상관 없이 가능한 이기도합니다. 이 경우에, sem에서 데이터 컬렉션 여러 세션에서 할 수 있습니다. 초기 3D 재구성 또는 적어도 낮은 또는 중간 해상도 데이터의 평가 대상 식별 해야 할 수 있습니다. 또한, 기존의 조직학 얼룩 명시 LM에 대 한 (안 필요한 FLM)을 적용할 수 있습니다. 물론, 다른 옵션6,7,8 은18에 초기 논문에서 이미 시연으로 배열에 라벨 또는 유전자 형광 성 단백질 (XFPs) 인코딩 또는 미리 라벨을 포함 하는 항 체 와 샘플 준비 중 형광의 보전.
설명한 방법의 일반적인 제한은 특정 두께의 섹션 및 3D 볼륨의 결과 개별 샘플링을 사용 하 여: SEM 섹션 표면 (d에서에서 유일한 데이터 수집 이후 Z 해상도 섹션의 두께 만큼 좋은 수 선택 기본 에너지/방문 에너지에 epending). 이 결과 3D 볼륨 이방성 복, 예를 들어있다는 뜻., 100 nm3 경우 100 x 5 x 5 nm 섹션과 이미지 픽셀 크기가 5 nm 사용 됩니다. 1 µ m 아래 크기 범위에서 아주 작은 요소,이 대 한 진정한 ultrastructural 충분 한 않을 수 있습니다. 더 기술적인 한계 이미징 자동 SEM에서 사용 하는 무대의 정확도 이다. 이 때문에, 전체 대상 지역 몇 군데 되도록 무대 정확도의 규격 보다 더 큰 ROI를 선택할 필요가 있다.
블록-얼굴 이미징 방법 SBF SEM과 거짓말-sem의에 비해, 상호에 위에서 설명한 대로 이방성 복의 결정적인 단점이 있다. 거짓말-SEM, 5 nm3 x 5 x 5의 등방성 복 적절 한 드리프트 보정 장소에 있을 때 얻을 수 있습니다.
배열의 준비 하는 동안 섹션의 손실로 인해 재건 볼륨에서 간격 SBF SEM와 거짓말-SEM. 발생 하지 문제가 있을 접착제에 의해 좋은 리본 안정화, 일반적으로 이것이 리본의 마지막 부분에 대 한 문제: 나이프는 속눈썹을 사용 하 여에서 그것을 풀어 놓을 때 손상 될 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험의 모든 20-50 단원의 한 부분 손실 않습니다 하지 영향 이미지 등록.
다른 한편으로, 배열 후 얼룩 가능성 좋은 신호 및 SEM 이미징, 여기에 표시 된 루트 팁 냉동 고압 등 약하게 금속된 샘플에도 대비 수 여. 따라서, 수많은 화학 고정 및 금속 단계에 의해 최적의 ultrastructural 보존 타협을 필요는 없습니다. 또한, 중간 정도의 경화와 병 리 실험실에서 일상적인 샘플 우수한 데이터10제공합니다. 일반적으로 이러한 포스트 포함 대비 향상 SBF SEM과 거짓말-sem의 대 한 불가능 하다. 또한, 이러한 메서드는 파괴 하 고, 이후 즉, 이미징, 계층적 다른 해상도 및 사이트에서 이미징 또는 시간에서 나중에 지점에서 반복된 이미징 동안 샘플 사용 불가능 합니다. 원칙적으로, 무제한 볼륨, 큰 FOVs (예를 들어, connectomics에서 전체 마우스 두뇌에 대 한 여러 밀리미터까지)으로 구성 된 모자이크, 바느질에 의해 만들어지고 섹션의 거 대 한 숫자에 거짓말-SEM, 100 µ m x 100 µ m 넘어 FOVs에에서 의해 취득 될 수 있다 일상적인 악기와 함께 달성 하기 어렵다입니다.
SBF SEM과 거짓말-sem의 위에서 언급 한 방법 모두 단면화 및 완전 자동화 된 방식으로 같은 악기 내 이미징 수행 이후 설명에 워크플로 추가 자동화 확실 한 장점 것입니다. 단면 자동화의 한 종류 존재: Kapton 테이프를 사용 하 여 기판 등으로 배열 한 FLM에서 이미지 어렵다 하지만 The ATUMtome12 생성 하 고 수집 섹션의 수천 수 있습니다. 여기에 사용 되는 ITO 코팅 coverslips에 최고 해상도 영상 가능 해야 합니다. 자동화에 대 한 추가, 매우 바람직한 대상 FLM 데이터 스택 기록 될 것 이다. 다른 한편으로, 자동화 비쌀 수 있다 고 기판 홀더를 제외 하면 여기에 제시 된 워크플로 조건 (하드웨어)만 계측 일상적인 EM 실험실 또는 핵심 시설, 낮은 만들기에서 일반적으로 사용할 수 있는 액세스 수준.

조직 ultrastructural 해상도 큰 볼륨을 재구성을 위해 SEM에 따라 다른 이미징 방식의 번호 사용된1되었습니다: 포괄적인 리뷰는 사용할 수 있는 예., SBF SEM2, 거짓말-sem의3및 배열에 대 한 (에서)4의 tomography 후자의 방법 샘플 자료는 다양 한 기판에 직렬 섹션으로 유지 되지만, SBF SEM과 거짓말-sem의 파괴적인 방법이 있습니다, 샘플 블록에 노력 하 고 이미징 동안 그것을 사용. SEM에 수 지의 충전 때문에 그들은 또한 강력 하 게 금속된 샘플 블록5에 따라 다릅니다.
다른 한편으로, 특정 세포 또는 조직 샘플 내 관심의 구조 식별 특히 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)6,,78에서 이익 수 있습니다. FLM을 사용 하 여 대상에 대 한 걸이 형광 신호9를 끄다 것 때문에 많은 양의 중 금속의 응용 프로그램을 하겠습니다. 이러한만 약간 금속된 샘플에 대 한에 배열 될 수 있습니다 쉽게 후 무거운 금속으로 얼룩진 LM 이미징 후 이후 선택 방법입니다. 또한, 샘플의 거의 모든 종류에서 사용할 수 있습니다, 그리고 심지어 일상적인 샘플의 병리학에서 보물 가슴10.
또 다른 큰 장점은 계층적11 또는 다중 해상도 이미지12에 대 한 잠재력은: 모든 고해상도 이미지를 필요는 없습니다, 목표는 다른 형식 (예를 들어, FLM) 또는 선택할 수 있습니다 저해상도 SEM 이미지입니다. 만 재미 있는 지역 조직 또는 세포 인구에서 고해상도의 이미징 디지털 데이터 저장 공간을 절약 하 고 쉽게 처리 하는 작은 이미지 데이터 세트를 생성. 여기, AT 워크플로 오히려 약하게 금속된 샘플을 사용 하 여 설명 된다: 식물의 뿌리 (애기 thaliana) 냉동 고압 친수성 수 지에 포함 된.
배열 준비, 스테인드, 그리고 FLM에 SEM, 몇 군데 고 이미지 스택을 등록 하는 방법을 설명 합니다. 또한, FLM 볼륨의 3D 개조를 사용 하 여 나노 해상도 sem 이미징에 대 한 특정 셀을 선택 하는 방법을 보여 줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

혼합된 셀 인구 또는 조직 내에서 ultrastructural 해상도에서 특정 셀을 대상으로 하는 것은 계층적 이미징 빛과 전자 현미경의 조합을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 수 지에 포함 된 샘플 배열 ultrathin 섹션의 수백의 리본 메뉴의 구성으로 구분 되며, 실리콘 웨이퍼 또는 導 코팅된 coverslips의 조각에. 어레이 낮은 해상도 fluorophores 후 스마트폰 카메라 또는 급속 한 큰 지역 개요에 대 한 가벼운 현미경 (LM) 또는 넓은 분야 형광 현미경 (형광 가벼운 현미경 검사 법 (FLM)) 같은 디지털 소비자를 사용 하 여 몇 군데. 중 금속으로 얼룩 후, 후 배열 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 몇 군데는. 대상 선택 FLM에 의해 생성 된 3 차원 복원 또는 아무 형광 마커를 사용할 수 있는 경우 중간 해상도 SEM 이미지 스택에서 만든 3D 개조에서 가능 하다. Ultrastructural 분석에 대 한 선택된 대상 마지막으로 고해상도에서 SEM에 기록 됩니다 (몇 나노미터 이미지 픽셀). 리본 처리 도구 어떤 ultramicrotome에 개조 될 수 있는 시연입니다. 그것은 배열 생산 및 단면 칼 보트에서 기판 제거와 함께 도움이 됩니다. Sem에서의 배열 자동된 이미징 허용 하는 소프트웨어 플랫폼을 설명 합니다. 직렬 블록-얼굴 SEM (SBF-SEM) 집중 된 이온 빔 SEM (거짓말-SEM) 등의 큰 볼륨 그들 데이터를 생성 하는 다른 방법에 비해이 방법은 두 가지 주요 이점이 있다: (1) 수 지에 포함 된 샘플은 보존, 이기는 하지만 썬 업 버전. 그것은 다른 방법으로 얼룩진 고 다른 해상도로 촬영 될 수 있습니다. (2)로 섹션 후 얼룩이 질 수 있다, sem의 이미징에 대 한 대비를 소개 하는 조직 블록 전도성 렌더링 중 금속으로 샘플 강하게 블록 스테인드를 사용 하 여 필요는 없습니다. 이것은 메서드를 사용 하면 다양 한 재료와 생물학 질문에 적용할 수 있습니다. 특히 사용된 자료 예를 들어, 생 은행 및 병 리 실험실에서 수 있습니다 직접 포함 되며 3d에서 재구성.

워크플로 수 지 블록에 포함 된 샘플 (그림 1) 시작을 여기 설명 합니다. 샘플 준비 하는 동안 일부 중 금속은 조직에 도입 되어야 하지만 그것은 오히려 강한 금속에 대 한 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 필요가 없습니다. 그림 1A (유채과 야채) 블록-스테인드 통상 1% OsO4 와 1 %uranyl 아세테이트, 그림 1B 에서 애기 루트는 약하게만 메탈 0.5 %uranyl 아세테이트를 사용 하 여 식물 뿌리를 보여 줍니다. 형광 담금질 하는 경향이 일부 중 금속 후자 샘플 유형 상호 접근에 대 한 가장 적합 하다. 몇 백 섹션의 배열 수 있는 전용된 기판 홀더 (그림 2)와 (그림 1C)을 생산. 형광 라벨 후 같은 배열 표준 넓은 필드 FLM (그림 1D)에 몇 군데 다음 헤비 메탈 솔루션 스테인드 되며 다른 해상도 (그림 1E-G) SEM에 몇 군데.
배열, 재현할 수 세대에 대 한 중요 한 도구는 기판에 톰의 칼 보트에서 여러 리본을 배치 하는 경우에 특히는 기판 홀더 (그림 2A, 저자의 연구실에 맞춤형)와 점보 다이아몬드 현미경 슬라이드 (그림 2B)에 맞게 충분히 큰 보트 칼. 리본의 좋은 관측 수 평면 초승달 모양 필요 하 고 플라즈마 기판의 청소에 의해 달성 될 수 있다: 증류수의 작은 물방울 그림 2C (치료 기판)에서 기판에 렌즈 모양의 구조를 형성 한다 박막 (그림 2D, 플라즈마 활성화 기판) 하지만. 이러한 조건 하에서 ITO 코팅 coverslip의 마른 부분에 부착 된 리본은 쉽게 시각화 (그림 2E)와 관찰 하 고 수 물에서 기판의 리프트 아웃 동안 제어.
예를 들어, 배열 propidium 요오드 화물 식물 세포 벽을 물 들일 표준 넓은 필드 FLM (그림 3A)와 몇 군데 있었다. 이후 섹션은 100 nm 두께, 심지어 과도 같이 얼룩 약간 모호 하 게 소개. 등록 후, 완전히 복원 된 볼륨에 포함 된 두 개의 셀 3d에서 고해상도 이미징 이미지 스택 (그림 3B)에서 선정 되었다 (참고 추가 영화 S1). 추가 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산과 얼룩, 다음 배열 몇 군데는 SEM. 개요, 60 nm 이미지 픽셀; 기록 표시 그림 3 C 이미지의 중앙에 어두운 광장 어디 자동 초점 기능, 실행 하 고 추가 복용량 약간의 오염에 지도 위치를 나타냅니다. ROIs 그 직렬 섹션 (조각 51 248 435 조각의 총에서)에 적합 한 5 nm 이미지 픽셀 크기 다음 기록 된 FLM 스택에서 선택한 두 개의 대상 셀을 포함 하 (그림 3D; 보충 영화 S2참고).
여기에 설명 된 sem에서 배열의 자동화 된 계층적 이미징 소프트웨어/하드웨어 플랫폼 솔루션 ZEISS 아틀라스 5로 이루어졌다. 전체 배열에 대 한 개요와 SE 검출기를 사용 하 여 만들어진 첫째, 매우 큰 (1000 nm) 이미지 픽셀 및 매우 낮은 유지 시간 (그림 4A). ROI만 조직 개요 첫 번째 섹션에 배치 하 고 배열의 다른 모든 섹션에 전파 했다. 이 섹션 세트 60 nm 이미지 픽셀 (그림 4B) 긴 망설임 시간을 사용 하 여 다음 기록 했다. 마지막으로, 두 대상 셀에 1을 더한 단계 부정확, 담당 하는 세포를 둘러싼의 "레이어"를 포함 하는 사이트 집합 다음 매개 변수를 설정 했다: ESB (에너지 선택적 후방 산란) 검출기, 5 nm 이미지 픽셀, 아주 긴 (40 µs) 면만 시간 ( 그림 4C). 이러한 이미지를 확대 subcellular 세부 사항 (그림 4D) 그들 (V), 미토 콘 드리 아 (M), 핵 (N), 및 바인딩과 그물 (화살표) 등을 보여 줍니다. 또한 하나의 목표 셀의 subcellular 세부 사항에 전체 배열에 대 한 개요에서 확대에 대 한 보충 영화 s 3 을 참조 하십시오.
여기 (200 섹션)에 표시 된 배열 플러스 추가 250 섹션 중 약 8 h 생산 했다, LM, 그리고 언젠가 FLM에 (수동으로) 기록에 대 한 얼룩 한 밤. 후 얼룩 개별 배열 수에 따라 총에서 약 1-2 시간 걸립니다. Sem의 녹음에 대 한 몇 시간 아틀라스 실행 설정 및 자동된 녹음은 3-4 h 중간 해상도 (60 nm 픽셀 크기) 섹션 세트 (200 섹션, 450 x 200 µ m2) 및 고해상도 (5 nm 픽셀 크기)에 대 한 약 5 일 투자 수익 (200 섹션, 55 x 30 µ m2) 두 개의 대상 셀을 포함 하. Note는 여기에 표시 된 샘플의 낮은 금속 내용으로 인해 매우 느린 검색 속도 고해상도 투자 수익에 대 한 40 µs의 드웰 타임 (현재 사용할 수 있는 탐지기)에 대 한 암시는 좋은 신호 대 잡음 검출을 도달 하는 데 사용할 했다.
일부의 단계에서 전체 워크플로 경향이 함정: 이상적으로 리본 더 많거나 적은 직선과 (그림 5A) 올바른 순서로 배치 해야. 그러나, 구부러진 (그림 5B), 곡선된 (그림 5D), 또는 심지어 깨진된 리본 종종 생산 됩니다. 이 비대칭 또는 unevenly 침투 샘플에서 뿐만 아니라 잘못 된 트리밍 (선도 및 정확 하 게 병렬), 또는 비-균일 하 게 적용된 접착제, 발생할 수 있습니다. 특히 성가신 샘플은 부드럽고 매우 하드 구성 요소가 포함 된. 후자의 구성 요소 (그림 5C) 여기에 표시 된 식물 뿌리의 세포 벽과 같은 침투 하기 어려울 수 있습니다. 이 경우, 주름 (화살촉) 가변 압축 및 단면 동안 휴식에 의해 쉽게 발생할 수 있습니다. 대 한 sem에서 이미지, 자동 곡선된 리본 되지 않습니다 큰 문제 이후는 ROIs 리본의 곡률에 맞게 회전 될 수 있습니다.
프로토콜에서 다른 중요 한 단계 얼룩: 부적절 한 세척 잔류물 (그림 5E, F), 섹션에서 발생할 수 있고 최악의 경우 ( 그림 5 층에 두 개의 대상 셀 중 하나에 원) 가장 흥미로운 영역을 커버. 또한, 먼지 (그림 5D, 강하게 산란 입자) 더러운 기판 캐리어와 함께 칼 보트, 예를 들면에 소개는 심각한 문제가 발생할 수 있습니다: FLM, 먼지는 높은 형광 수 (cf. 보충 영화에에서 몇 조각 S1) 일부 등록 알고리즘 작동 하지 않습니다에 같은 정도. 그러나, TrakEM17 에 "정렬" 기능 추가 영화 s 1에서 같이 이러한 스택을 처리할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> 그림 1: 워크플로 상호 계층적 이미징. 수 지 블록 (A, 강력 하 게 증 착된 샘플)에 포함 된 샘플에서 시작, 샘플 첫 손질된 (B, 약하게 금속된 샘플) 이며 다음 배열 직렬 섹션 (C)의 여러 개의 리본으로 구성 된, 여기에 배치 된 ITO 코팅 coverslip ultramicrotome는을 사용 하 여 생산 됩니다. 형광 염료와 염색, 후 이미지의 넓은 필드 FLM (D)에 기록 됩니다. 소금 추가 라운드 중 금속 얼룩 후 스택은 몇 군데 SEM (E-G)에서 다른 해상도 (이미지 픽셀 크기). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> 그림 2: 배열의 준비 도구. 표준 ultramicrotome (A)에 연결 하는 움직임의 7 축 micromanipulators에서 조립 하는 기판 홀더: 나사, 동그라미, 강조는 (1) 수직 및 수평 운동 (2) 및 (3) 기판 캐리어의 기울이기 . 여기 슬라이드 크기의 알루미늄 캐리어 (B)에 장착 된 플라즈마 활성화 실리콘 웨이퍼의 조각으로 대형 기판 (화살표)를 맞게 특대 보트 점보 다이아몬드 칼. 20 µ L 방울 증류수 치료 실리콘 웨이퍼 기판 (C) 또는 플라즈마 활성화 기판 (D)에 배치. 4 리본 칼 보트에 떠 있는 그들의 낮은 끝에 의해 이토 코팅 coverslip에 연결 된. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> 그림 3: LM 데이터와 sem의 데이터의 상관 관계. FLM (A, B)와 (A, C) 개요 및 대상 셀 (B, D) 기록 및 SEM (C, D). (B) 소프트웨어 줌 이며 원래 데이터 기록 했다 1,388 x 1040 화소 카메라 칩에 40 X 객관적 렌즈와 60 nm 이미지 픽셀 크기, 및 (D) (C)는 기록 하는 동안 5 nm 이미지 픽셀 크기를 보여주는 진정한 해상도 SEM.에 있는 증가 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> 그림 4: 계층적 ZEISS 아틀라스 5 제공을 사용 하 여 sem에서 이미지 배열 개요 1000 nm 이미지 픽셀 SE 검출기 (A)를 사용 하 여 기록. 섹션은 모든 섹션에서 조직에 배치 하 고 60 nm 이미지 픽셀 (B) 기록 수익 설정 합니다. 사이트 설정 직렬 수익 대상 셀에 배치 하 고 5 nm 이미지 픽셀 (C)와 함께 기록 합니다. (D) 같은 고해상도 이미지로 확대, 그들 (V), 핵 (N), 미토 콘 드리 아 (M), 및 바인딩과 그물 (화살표) 같은 세포내 막 구획 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> 그림 5: 전형적인 문제. 1. 단면 과정에서 발생 하는: 구부러진 (B) 또는 곡선된 리본 (D), 또는 심지어 주름 (C) 리본 이토 코팅 coverslips 이상적으로 직선 (A), 하지만 불규칙 압축 단면 중에 발생할 수 있습니다. 2. 단면 및 얼룩 동안 기판 및 물, 예를 들면에 리본 처리로 인 한: 빛 입자를 기판 (D)에 뿌리고, 섹션 e에서(원), 또는 먼지에 물방울의 가장자리 조직 부족 때문에 밖으로 얼룩져 (F) 얼룩 후 세척. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S1: FLM 이미지 스택. 435 이미지 피지16 TrakEM17 를 사용 하 여 정렬 하 고 동영상 파일 (.avi)로 저장 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S2: SEM 이미지 스택. 210 이미지 피지16 TrakEM17를 사용 하 여 정렬. 이 데이터 집합의 원래 스택 (300 이미지) 15 기가바이트 했다. 3.3 GB에서 스택 (정렬 하 고 두 셀을 대상만을 자르기) 후 소형화, 그것은 x에 확장 했다 y 0.2의 요인에 의해 피지를 사용 하 여 및 다음.avi 동영상으로 저장. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S3:는 SEM.에서 다른 해상도 수준으로 확대 영화에서 만들어지고.mp4 형식에서 아틀라스 5 소프트웨어에서 내보낸. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇 군데

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

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Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

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질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

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