Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela concessão FKZ 13GW0044 do Ministério Federal alemão de educação e pesquisa, projeto MorphiQuant-3D. Agradecemos Bartels Carolin para suporte técnico.

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KIT recebeu os reembolsos por Boeckeler instrumentos para fornecimento de um modelo funcional do titular do substrato. Marlene Thaler é funcionário da ZEISS microscopia GmbH, fabricante de sistemas de microscópio mencionadas neste artigo. Além disso, a ZEISS oferece certas soluções como pacotes de solução de Atlas de ZEISS para uma ampla gama de aplicações em imagens 3D, de grande área para SEM e FIB-SEM instrumentos. Todos os outros autores não têm nada para divulgar.

Demonstrou-se um fluxo de trabalho para o direcionamento de células específicas dentro de um tecido por AT hierárquica multimodal: uma amostra de resina-incorporado é rasgada em matrizes de seriais seções, que são colocadas em um substrato condutor usando um suporte de substrato personalizados. Depois de rotulagem com um fluoróforo e imagem no FLM, o volume reconstruído é usado para selecionar as células alvo. Após coloração adicionais rodadas com metais pesados para introduzir o contraste, esses destinos são imaginados durante várias cem seções em nanoescala resolução em um SEM usar uma plataforma de software automatizado.
Para a produção de matrizes densamente com várias fitas longas, um titular de substrato semelhante à descrita aqui é necessário. Uma pessoa hábil e paciente pode ser capaz de anexar várias fitas para um substrato de silício, semi imerso no barco a faca e recuperar a matriz, reduzindo gradualmente o nível da água até as fitas estão sentados sobre o substrato. No entanto, na nossa experiência, há uma tendência para quebrar a formação quando o substrato está tocando em qualquer parte do barco faca (cf. nota no 1.3.2 no protocolo). Além disso, este procedimento é muito mais difícil com substratos revestidos ITO: (1) devido a transparência do vidro-ITO, é difícil ver a borda da água onde as extremidades das fitas tem que ser anexado; e (2) porque a superfície ITO-revestido é muito mais difícil do que a bolacha de silício altamente polido, as fitas tendem a quebrar durante o elevador e fragmentos menores, consistindo de algumas seções podem flutuar, destruindo assim a ordem das seções.
O fluxo de trabalho inteiro também é viável sem correlação com dados FLM. Neste caso, coleta de dados no SEM pode ter que ser executadas em várias sessões. Uma reconstrução 3D inicial ou pelo menos a avaliação de dados de baixa ou média resolução pode ser necessária para identificar alvos. Além disso, manchas histológicas convencionais para brightfield LM (não exigindo FLM) podem ser aplicadas. Claro que outras opções6,7,8 são anticorpos rotulagem nos arrays, como já demonstrado no livro inicial sobre a18, ou geneticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) ou pré-incorporação de rotulagem com preservação da fluorescência durante a preparação da amostra.
Uma limitação geral do método discutido é o uso de seções de uma certa espessura e a amostragem discreta resultante do volume 3D: resolução em Z só pode ser tão bom quanto a espessura das seções, desde que o SEM recolhe apenas os dados da superfície de seção (d epending sobre a energia de energia primária/aterragem selecionada). Isto significa que o volume 3D resultante tem voxels anisotrópicos, por exemplo., 5 x 5 x 100 nm3 se 100 nm seções e um tamanho de pixel de imagem de 5 nm são usados. Para entidades muito pequenas em uma escala de tamanho abaixo de 1 µm, isto pode não ser suficiente para uma verdadeira descrição ultraestrutural. Uma limitação mais técnica é a precisão do palco usado no SEM para automatizada de imagem. Devido a isto, é necessário escolher um ROI maior do que as especificações de precisão do palco para garantir que a área de destino completo é fotografada.
Comparado a SBF-SEM e FIB-SEM como métodos de imagem de cara-de-bloco, o correlativo AT tem a desvantagem definitiva de voxels anisotrópicos, conforme descrito acima. Com FIB-SEM, voxels isotrópicos de 5 x 5 x 5 nm3 podem ser obtidos quando uma correção adequada deriva está no local.
Lacunas no volume reconstruído devido à perda de seções durante a preparação de matrizes podem também ser uma preocupação que não é encontrada com a SBF-SEM ou FIB-SEM. Com a estabilização de bom da fita pela colagem, geralmente é apenas um problema para a última seção de uma fita: pode ser danificado quando liberá-lo do fio do navalha, usando o cílio. No entanto, em nossa experiência, a perda de uma seção em todas as seções de 20 – 50 não influi registro de imagem.
Por outro lado, a possibilidade de pós-manchar matrizes confere bom sinal e contraste para a imagem latente SEM, mesmo em amostras fracamente metalizadas, tais como a alta pressão congelados dicas de raiz, mostradas aqui. Portanto, não é necessário comprometer óptima preservação ultraestrutural por numerosos fixação química e passos de metalização. Além disso, amostras de rotina do laboratório de patologia com graus intermédios de metalização entregam dados excelente10. Tal um realce de contraste pós-incorporação não é possível para SBF-SEM e FIB-SEM em geral. Além disso, desde que estes métodos são destrutivos, ou seja, consumindo a amostra durante a geração de imagens, hierárquica em sites e diferentes resoluções de imagem ou imagens repetidas em pontos mais tarde no tempo é impossível. Em princípio, volumes ilimitados, consistindo de grandes FOVs (por exemplo, até vários milímetros para cérebro de rato inteiro em connectomics) criado por mosaicos de costura, e um número enorme de seções pode ser adquirido por AT, enquanto na FIB-SEM, FOVs além de 100 µm x 100 µm são difíceis de alcançar com instrumentos de rotina.
Mais automação de fluxo de trabalho-AT descrito seria uma vantagem definitiva, desde que os métodos acima mencionados SBF-SEM e FIB-SEM realizar tanto de seccionamento e de imagem dentro o mesmo instrumento de forma totalmente automatizada. Existe um tipo de automação de corte: ATUMtome The12 pode gerar e coletar milhares de seções, mas o uso de fita Kapton como um substrato faz com que tais matrizes difíceis de imagem em um FLM. Sobre as lamelas ITO-revestido usadas aqui, imagem de super-resolução até deve ser possível. Um alvo mais longe, muito desejável para automação seria a gravação de pilhas de dados FLM. Por outro lado, automação pode ser cara e exceto o titular do substrato, o fluxo de trabalho aqui apresentado baseia-se (em termos de hardware) apenas na instrumentação geralmente disponível em uma rotina EM laboratório ou núcleo facilidade, tornando-o baixo nível de acesso.

Para grandes volumes de tecido na resolução ultraestrutural de reconstruir um número de diferentes abordagens de imagens baseado em SEM ter sido usado1: avaliações abrangentes são disponíveis por exemplo., SBF-SEM2, FIB-SEM3e matriz Tomografia computadorizada (no)4. Enquanto para o último método material de amostra é preservado como uma matriz de seriais seções sobre um substrato, SBF-SEM e FIB-SEM são métodos destrutivos, trabalhando no bloco de amostra e consumi-la durante a imagem latente. Devido a carga da resina no SEM, eles também dependem fortemente metalizado amostra blocos5.
Por outro lado, identificar certas células ou estruturas de interesse dentro de uma amostra de tecido pode lucrar particularmente correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)6,7,8. Usar o FLM para direcionamento impede a aplicação de grandes quantidades de metais pesados desde que isto iria saciar a fluorescência sinal9. Para tais apenas amostras ligeiramente metalizadas, AT é o método de escolha como matrizes podem ser facilmente pós-manchadas com heavy metal depois da imagem latente de LM. Além disso, quase qualquer tipo de amostra pode ser usado para a AT, amostras de rotina nem do patologista tesouro peito10.
Outra grande vantagem da AT é o potencial para hierárquico11 ou multi resolução de imagem12: não é necessário para tudo em alta resolução de imagem, como alvos podem ser selecionados em uma modalidade diferente (por exemplo, FLM) ou em imagens de baixa resolução SEM. Somente as regiões interessantes de uma população de tecido ou célula em alta resolução de imagem economiza espaço de armazenamento de dados digitais e produz pequenos conjuntos de dados de imagem, que são mais fáceis de lidar. Aqui, o fluxo de trabalho AT é demonstrado usando uma amostra bastante fracamente metalizada: alta pressão congelado as raízes das plantas (Arabidopsis thaliana) incorporado em resina hidrofílica.
Como as matrizes são preparadas, manchadas e fotografadas em FLM e SEM, e como as pilhas de imagem são registradas são explicados. Além disso, como a reconstrução 3D do volume FLM pode ser usada para selecionar células específicas para a imagem latente no SEM em nanoescala resolução é ilustrada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Direcionamento de células específicas na resolução ultraestrutural dentro de uma população mista de célula ou um tecido pode ser conseguida de imagem hierárquica usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica. Amostras embutidas resina são seccionadas em matrizes consiste em fitas de centenas de seções ultra-finas e depositadas em pedaços de bolacha de silicone ou lamelas feito revestidas. Matrizes são imagens em baixa resolução usando um consumidor digital como a câmera do smartphone ou microscópio de luz (LM) para uma visão geral rápida de grande área ou um microscópio de fluorescência de campo largo (luz a microscopia de fluorescência (FLM)) após a rotulagem com fluorophores. Depois da pós-coloração com metais pesados, matrizes são fotografadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Seleção de alvos é possível partir de reconstruções 3D geradas por FLM ou reconstruções 3D feitas das pilhas SEM imagem em resolução intermediária se sem marcadores fluorescentes estão disponíveis. Para análise ultraestrutural, alvos selecionados são finalmente gravou no SEM em alta resolução (pixels de imagem de alguns nanômetros). Uma ferramenta de manipulação de fita que pode ser adaptada para qualquer ultramicrotome é demonstrada. Ajuda com produção de matriz e remoção de substrato do barco faca corte. Uma plataforma de software que permite a imagem automatizada de matrizes na SEM é discutida. Em comparação com outros métodos de geração de dados de grande volume EM, tais como SEM rosto-bloco serial (SBF-SEM) ou feixe de íon focalizado SEM (FIB-SEM), essa abordagem tem duas vantagens principais: (1) a amostra de resina-incorporado é conservada, embora em uma versão cortada. Pode ser manchado de maneiras diferentes e fotografada com diferentes resoluções. (2) uma vez que as seções podem ser manchadas de pós, não é necessário usar amostras fortemente manchada de bloco com metais pesados para introduzir o contraste para a imagem latente SEM ou processar blocos o tecido condutor. Isto torna o método aplicável a uma grande variedade de questões biológicas e materiais. Materiais particularmente prefixado por exemplo, de bancos de biópsia e laboratórios de patologia, pode diretamente ser incorporado e reconstruído em 3D.

O fluxo de trabalho descrito aqui (Figura 1) começa com uma amostra incorporada em um bloco de resina. Durante a preparação da amostra, alguns metais pesados devem ser introduzidas no tecido, mas não é necessário usar protocolos otimizados para metalização bastante forte. A figura 1A mostra uma raiz de planta (agrião) bloco-manchado convencionalmente com 1% OsO4 e 1% de acetato de uranilo, enquanto a raiz de Arabidopsis na figura 1B é apenas fracamente metalizado usando acetato de uranilo 0,5%. O tipo de amostra este último é mais adequado para abordagens correlativas como alguns metais pesados tendem a saciar a fluorescência. Com um suporte dedicado do substrato (Figura 2), matrizes de várias centenas de seções podem ser produzido (Figura 1). Depois etiquetando fluorescente, como matrizes é fotografado em um FLM de campo amplo padrão (Figura 1), em seguida, corado com soluções de heavy metal e fotografado em um SEM em resoluções diferentes (Figura 1E–G).
Ferramentas importantes para a geração reprodutível de matrizes, particularmente quando colocando várias fitas de barco de faca do micrótomo sobre um substrato, são o titular do substrato (Figura 2A, personalizados em laboratório dos autores) e um diamante de Jumbo faca com um barco suficientemente grande para acomodar corrediças do microscópio (Figura 2B). Um menisco plano, permitindo que a boa observação das fitas, é necessário e pode ser alcançado por plasma limpeza do substrato: uma pequena gota de água destilada não deve formar uma estrutura de lente sobre o substrato, como na Figura 2 (substrato não tratado), Mas uma película fina (Figura 2D, substrato de plasma ativado). Nestas condições, fitas anexadas à parte seca de uma lamela ITO-revestido são facilmente visualizados (Figura 2E) e podem ser observadas e controladas durante o elevador do substrato da água.
Por exemplo, matrizes manchados com iodeto de propidium para rotular a parede celular das plantas foram fotografadas com um padrão amplo campo FLM (Figura 3A). Uma vez que as seções são apenas 100 nm grossa, nem excessivamente manchando conforme mostrado aqui introduz pouco ofuscamento. Após o registo, selecionaram-se as duas células completamente fechadas no volume reconstruído da pilha de imagem (Figura 3B) para geração de imagens de alta resolução em 3D (Veja também Suplementar filme S1). Após coloração adicional com citrato de acetato e chumbo de uranilo, as matrizes foram fotografadas no SEM. Figura 3 C mostra uma visão geral, gravada com 60 pixels da imagem do nm; o quadrado escuro no centro da imagem indica a posição onde as funções de autofocus foram executadas, e a dose adicional levou à contaminação ligeira. Adequado de ROIs em secções seriais (fatias 51 para 248 de 435 fatias no total) que contém as células de dois alvo selecionadas na pilha de FLM então foram gravadas com um tamanho de pixel de imagem nm 5 (Figura 3D; ver também Suplementar filme S2).
Imagem hierárquica automatizada das matrizes no SEM descrito aqui foi feita com a solução de plataforma de software e de hardware ZEISS Atlas 5. Primeiro, uma visão geral de todo o conjunto foi criada usando o detector SE, com muito grandes (1.000 nm) imagem pixels e tempo de permanência muito baixa (Figura 4A). Um ROI descrevendo apenas o tecido foi colocado na primeira seção e propagado para todas as outras seções da matriz. Este conjunto de seção foi então gravado com 60 pixels de imagem nm usando um longo tempo de interrupção (Figura 4B). Finalmente, um conjunto de site, que contém as células dois alvo mais um "camada" de em torno de células para contabilizar a imprecisão do palco, foi criado com os seguintes parâmetros: detector de ESB (Backscatter seletiva de energia), imagem de nm 5 pixels, muito longos (40 µs) habitam o tempo ( Figura 4). Aumentar o zoom em uma imagem tão mostra detalhes subcellular (Figura 4), tais como vacúolos (V), mitocôndria (M), núcleo (N) e retículo endoplasmático (setas). Veja também o S3 suplementar do filme para aumentar o zoom em de uma visão geral da matriz de todo o detalhe subcellular de uma célula-alvo.
A matriz mostrada aqui (200 seções) e mais um adicional de 250 seções levou cerca de 8 h para produzir, uma noite a mancha para LM e um dia para gravar (manualmente) para o FLM. Pós-coloração leva cerca de 1-2h, no total, dependendo do número de matrizes individuais. Para a gravação de SEM, algumas horas são necessárias para configurar a execução do Atlas, e gravação automatizada foi 3 – 4 h para o conjunto de seção intermediária da resolução (tamanho de pixel de 60 nm) (200 seções, 450 x 200 µm2) e a cerca de 5 dias para o de alta resolução (5 nm pixel tamanho) ROI contendo as células dois alvo (200 seções, 55 x 30 µm2). Note que devido ao baixo teor de metal da amostra mostrado aqui, tinha uma velocidade de digitalização muito lenta ser usado para alcançar uma boa detecção de sinal-ruído, que implicou (para o detector atualmente disponível) um tempo de interrupção de 40 µs para o ROI de alta resolução.
Existem várias etapas do fluxo de trabalho inteiro propenso a armadilhas: idealmente fitas devem ser mais ou menos em linha reta e colocados na ordem correta (Figura 5A). No entanto, dobrada (Figura 5B), curvas (Figura 5) ou fitas mesmo quebradas muitas vezes são produzidas. Isso pode resultar devido a remoção incorreta (líder e extremidade posterior não é exatamente paralela) ou adesivo não uniformemente aplicado, mas também de uma amostra desigualmente infiltrada ou assimétrica. São particularmente problemáticas amostras contendo componentes macios e muito difícil. Estes componentes podem ser difíceis de se infiltrar como a parede de pilha das raizes da planta mostrada aqui (Figura 5). Nesse caso, dobras (setas) facilmente podem ser causadas por compressão variável e relaxamento durante o corte. Para automatizada de imagem no SEM, fitas curvas não são um grande problema, desde o ROIs podem ser girado para acomodar a curvatura da faixa de opções.
Outro passo crítico no protocolo é de coloração: lavagem inadequada pode levar a resíduos na seção (Figura 5E, F) e na pior das hipóteses, cobrir a área mais interessante (círculo em uma das células dois alvo na Figura 5F). Além disso, a poeira (Figura 5, as partículas de espalhamento de luz fortemente) introduzida no barco de faca, por exemplo, com um portador de substrato sujo, pode causar sérios problemas: no FLM, a poeira pode ser altamente fluorescente (cf. algumas fatias em filme suplementar S1) a tal ponto que alguns algoritmos de registro não funcionam. A função de "Alinhar" em TrakEM17 , no entanto, pode manipular tais pilhas conforme demonstrado no Supplemental filme S1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho para a imagem hierárquica correlativa. A partir de uma amostra incorporado em um bloco de resina (A, amostra fortemente metalizada), a amostra é primeira aparada (B, amostra fracamente metalizada) e em seguida matrizes aqui consistindo de várias fitas de seriais seções (C), colocado em um ITO-revestido lamela, são produzidos usando um ultramicrotome. Após coloração com um corante fluorescente, pilhas de imagens são gravadas em um campo amplo FLM (D). Depois sais de coloração mais rodadas com heavy metal, pilhas são fotografadas em um SEM (E–G) em diferentes resoluções (tamanho do pixel de imagem). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figura 2: ferramentas para a preparação de matrizes. Titular de substrato montado de Micromanipuladores com sete eixos de movimento ligado a um padrão ultramicrotome (A): os parafusos, destacados com círculos, são para (2) movimento horizontal e vertical (1) e inclinação (3) da transportadora substrato . A faca enorme diamante com um tamanho grande barco para acomodar grandes substratos (seta), aqui com um pedaço de bolacha de silício ativado plasma montado sobre um portador de alumínio tamanho slide (B). 20 gotas de µ l de água destilada colocada em uma carcaça de bolacha de silício não tratada (C) ou em um substrato de plasma está ativado (D). Quatro fitas flutuando no barco a faca, anexado a uma lamela ITO-revestido por suas extremidades inferiores. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figura 3: correlação dos dados com dados SEM LM. Súmulas (A, C) e nas células-alvo (B, D), gravado com o FLM (A, B) e SEM (C, D). (B) é um software de zoom, e os dados originais foram gravados com uma lente de objetiva X 40 em um chip de 1.388 x 1.040 pixel câmera, enquanto (C) é gravado com 60 nm tamanho de pixel da imagem e (D) com 5 nm pixel tamanho da imagem, ilustrando o verdadeiro aumento da resolução no SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figura 4: hierárquica de imagem no SEM usando ZEISS Atlas 5 em Visão geral de uma matriz gravada com 1.000 pixels de imagem nm usando o detector SE (A). Seção define com o ROI colocados no tecido em cada seção e gravou com 60 pixels de imagem nm (B). Local define com um ROI serial colocado sobre células-alvo e gravou com pixels de imagem 5 nm (C). Ao aumentar o zoom em tais imagens de alta resolução (D), compartimentos de membrana intracelular como vacúolos (V), núcleo (N), mitocôndria (M) e retículo endoplasmático (setas) tornam-se visíveis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figura 5: problemas típicos. 1. decorrentes do processo de corte: fitas colocadas no ITO-revestido lamelas são idealmente reta (A), mas irregular compressão durante o corte podem causar dobrados (B) ou fitas curvas (D) ou até mesmo dobras (C). 2. causada pelo tratamento de substrato e fitas na água, por exemplo, durante o corte e coloração: luz espalhamento de partículas em substrato (D), borda de gotículas na seção (círculo em mi), ou sujeira esfregaste fora tecido devido à inadequada lavagem após coloração (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Suplementar filme S1: pilha de imagem FLM. 435 imagens alinhadas em Fiji16 usando TrakEM17 e salvo como arquivo de filme (. avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar filme S2: pilha de imagem SEM. 210 imagens alinhadas em Fiji16 usando TrakEM17. A pilha original (300 imagens) deste conjunto de dados foi de 15 GB. Para reduzir o tamanho da pilha de 3.3 GB (após o alinhamento e o corte de apenas as duas células-alvo), foi reduzida em x e y por um fator de 0.2 usando Fiji e salvo como. avi filme. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar filme S3: zoom com níveis diferentes de resolução na SEM. Filme criado em e exportados a partir do software Atlas 5 no formato. mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

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