Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грант FKZ 13GW0044 от немецкого федерального министерства для образования и научных исследований, проект MorphiQuant-3D. Мы благодарим Каролин Бартельс за технической поддержкой.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

KIT получил возмещение по Boeckeler инструментов для поставки функциональной модели держателя субстрата. Марлен Талер является сотрудником ZEISS микроскопии GmbH, производителя систем Микроскоп, упоминалось в этой статье. Кроме того ZEISS предлагает определенные решения, такие как пакеты решений ZEISS Атлас для широкого спектра применений в большой площади, 3D визуализация для SEM и FIB-SEM инструментов. Все другие авторы имеют ничего не разглашать.

Был продемонстрирован рабочий процесс для ориентации конкретных ячеек в пределах ткани по мультимодальной иерархических AT: смола встроенный образец нарезанный в массивы последовательных секций, которые размещаются на токопроводящих субстрата, используя специально разработанный субстрат держателя. После маркировки с Флюорофор и визуализации в FLM, восстановленный том используется для выбора целевых ячеек. После дополнительных пятнать раундов с тяжелыми металлами, ввести контраст, эти цели отражаются на несколько сотен разделов на наноуровне резолюции в SEM, используя платформу автоматизированного программного обеспечения.
Для производства плотно упакованных массивов с несколькими длинные ленты, необходим держатель субстрата, похож на описанный здесь. Квалифицированных и терпеливый человек может быть возможность прикрепить несколько лент на кремниевой подложке, частично погруженные в лодке, нож и получить массив, постепенно понижая уровень воды до тех пор, пока ленты, сидя на подложке. Однако, на наш опыт, существует тенденция разрушить формирования касатьясь субстрат любую часть лодки нож (см. Примечание в 1.3.2 в протоколе). Кроме того, эта процедура является гораздо более сложным с покрытием ITO подложки: (1) благодаря прозрачности стекла ITO, трудно увидеть край воды, где концы ленты должны быть прикреплены; и (2) потому что Ито покрытием поверхности гораздо грубее, чем высоко полированного кремниевой пластины, ленты, как правило, перерыв во время подъема и более мелкие фрагменты, состоящий из нескольких секций может плавать, таким образом разрушая порядка разделов.
Весь рабочий процесс также возможна без корреляции FLM данных. В этом случае сбор данных в SEM может потребоваться выполнить в нескольких сеансах. Первоначальный 3D-реконструкции или по крайней мере оценки данных с низким или средним разрешением может быть необходимо определить цели. Кроме того могут применяться обычные гистологические пятна для brightfield LM (не требующих FLM). Конечно другие варианты6,7,8 , антитела маркировки на массивах, как уже показали в первоначальный документ на18, или генетически закодированный флуоресцентных белков (XFP) или предварительно внедрение маркировки с сохранением флуоресценции во время подготовки проб.
Общее ограничение обсуждались метода является использование секций определенной толщины и результате дискретных выборки 3D-объем: резолюции в Z может быть только так хорошо, как толщина секций с SEM собирает только данные из раздела поверхности (d epending на выбранных энергии первичной энергии и посадки). Это означает, что результирующая 3D-объем анизотропной вокселей, например., 5 x 5 x 100 Нм3 если 100 Нм секций и размер пикселя изображения 5 Нм используются. Для очень малых и средних предприятий в диапазоне размеров ниже 1 мкм это не может быть достаточно для истинной ультраструктурных описание. Более техническим ограничением является точность этапа используется в SEM для автоматической обработки изображений. Благодаря этому необходимо выбрать ROI, больше, чем спецификации точности этап гарантировать, что образ полной целевой области.
По сравнению с SBF-SEM и FIB-SEM методы визуализации блок лицо, корреляционного AT имеет окончательное недостаток анизотропной вокселей, как описано выше. С FIB-SEM изотропным вокселей 5 x 5 x 5 Нм3 могут быть получены при коррекции надлежащего дрейф в месте.
Пробелы в реконструированных объем из-за потери разделов при подготовке массивов может быть озабоченность тем, что не встречается с SBF-SEM или FIB-SEM. С хорошим ленты стабилизации клеем, обычно это только проблема для последнего раздела ленты: он может быть поврежден при освобождении его от ножа, используя ресниц. Однако по нашему опыту, потеря одной секции в каждом разделы 20 – 50 не влияет регистрации изображения.
С другой стороны возможность после пятно массивов дает хороший сигнал и контрастность для SEM изображений, даже на слабо металлизированной образцы таких высокого давления замороженных корень советы, показанный здесь. Таким образом нет необходимости идти на компромисс оптимального ультраструктурных сохранения многочисленных химических фиксации и металлизации шаги. Кроме того обычные образцы из лаборатории патологии с промежуточной степени металлизации доставить10отличные данные. После внедрения контрастным усилением возможна не для SBF-SEM и FIB-SEM в целом. Кроме того, так как эти методы являются разрушительными, т.е., потребляя образца во время визуализации, иерархические изображений в различных резолюциях и сайты или повторяющихся изображений на более поздних этапах в времени невозможно. В принципе неограниченное количество томов, состоящий из большого FOVs (например, до нескольких миллиметров для всего мыши мозги в connectomics) созданный шить мозаики, и огромное количество секций может быть приобретена в то время как в FIB-SEM, FOVs за пределами 100 мкм x 100 мкм довольно трудно достичь с помощью обычных инструментов.
Дальнейшая автоматизация описанных AT-рабочего процесса будет определенное преимущество, поскольку вышеупомянутые методы SBF-SEM и FIB-SEM выполняют секционирование и изображений в пределах того же инструмента в полностью автоматическом режиме. Существует один вид автоматизации резании: ATUMtome12 может создавать и собирать тысячи секций, но использование Kapton ленты как субстрат делает такие массивы трудно изображение в FLM. На coverslips Ито покрытием, используемый здесь даже супер-резолюции изображений должно быть возможным. Кроме того, весьма желательно мишенью для автоматизации будет запись FLM стеков данных. С другой стороны, автоматизации может быть дорогим и за исключением держателя субстрата, рабочего процесса, представленные здесь зависит (с точки зрения оборудования) только приборы обычно доступны в обычной EM лаборатории ядро учреждении или, что делает его низкой уровень доступа.

Для реконструкции больших объемов ткани на ультраструктурные резолюции целый ряд различных изображений подходов, основанных на SEM были используется1: всеобъемлющие обзоры являются имеющиеся например., SBF-SEM2, Компания FIB-SEM3и массив Томография (в)4. Хотя для последнего метода образец материала сохраняется как массив последовательных секций на подложке, SBF-SEM и FIB-SEM являются разрушающими методами, работает на блоке образца и потребляющих его во время визуализации. Благодаря зарядки смолы в SEM, они также зависят от сильно металлизированной образца блоков5.
С другой стороны выявления определенных ячеек или структуры интереса в образец ткани может воспользоваться особенно коррелятивных света и электронной микроскопии (Клем)6,,78. С помощью FLM для ориентации исключает применение большого количества тяжелых металлов, так как это бы утолить флуоресценции сигнала9. Для таких лишь слегка металлизированной образцов AT является методом выбора, поскольку массивы могут быть легко пост окрашенных с тяжелых металлов после LM изображений. Кроме того почти любой тип образца могут быть использованы для AT, даже обычные образцы из патологоанатома сокровище грудь10.
Другим большим преимуществом на это потенциал для иерархических11 или множественным разрешением изображений12: это не нужно все в с высоким разрешением изображения, как целевые показатели могут быть выбраны в различной модальности (например, FLM) или в SEM изображения с низким разрешением. Imaging только интересных регионов ткани или клетки населения в высоким разрешением экономит пространство для хранения цифровых данных и производит меньше наборов данных изображения, которые проще в обращении. Здесь, в рабочий процесс проявляется с использованием довольно слабо металлизированной выборки: высокого давления замороженных корни растений (Arabidopsis thaliana) встроенный в гидрофильной смолы.
Объяснил, как массивы готовятся, витражи и отражаться в FLM и SEM, и как стеки изображений зарегистрированы. Кроме того как 3D-реконструкции FLM тома может использоваться для выбора конкретных ячеек для изображений в SEM в наноразмерных резолюции свидетельствует.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Ориентации конкретных ячеек на ультраструктурные резолюции в популяцию смешанных клеток или тканей может быть достиган иерархических изображений, используя сочетание света и электронной микроскопии. Образцы, встроенные в смоле секционного в массивы, состоящий из ленты сотен ультратонких секций и хранение на куски кремниевой пластины или кондуктивно покрытием coverslips. С низким разрешением, используя цифровые потребителей как смартфон камеры или световой микроскоп (LM) для быстрого большая площадь обзора или широкое поле флуоресцентным микроскопом (световой микроскопии флуоресцирования (FLM)) после маркировки с флуорофоров отражаются массивы. После после окрашивания с тяжелыми металлами, массивы отражаются в сканирующий электронный микроскоп (SEM). Выбор целей возможен из 3D реконструкций, порожденных FLM или 3D реконструкций, сделанные из SEM стеки изображений на промежуточных резолюции, если не флуоресцентные маркеры доступны. Ультраструктурные анализа, выбранных целей наконец записываются в SEM в с высоким разрешением (несколько пикселей изображения нанометр). Лента обработке инструмент, который может быть установлена на любой ultramicrotome продемонстрировал. Он помогает с массив производство и удаление подложки из резания ножа лодки. Программная платформа, которая позволяет автоматическое создание образов массивов в SEM обсуждается. По сравнению с другими методами генерации большого объема EM данных, такие как последовательный блок лицо SEM (SBF-SEM) или целенаправленного ионного пучка SEM (FIB-SEM), этот подход имеет два основных преимущества: (1) смолы встроенный образец сохраняется, хотя и в версии нарезанный вверх. Может быть пятнами различными способами и образы с различными разрешениями. (2) как разделы могут быть окрашены пост, нет необходимости использовать образцы сильно блок окрашенных с тяжелыми металлами, ввести контраст для SEM изображений или визуализации тканей блоков проводящие. Это делает метод применяется широкий спектр материалов и биологических вопросов. Особенно префиксом материалов например, биопсия банков и лаборатории патологии, можно непосредственно встроенные и реконструирован в 3D.

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Этот протокол нацелен на конкретных клеток в тканях для изображений на наноуровне резолюции с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM). Большое количество последовательных секций от смолы встроенный биологического материала сначала отражаются в световой микроскоп для идентификации цели и затем в иерархически в SEM.

Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Гепатоцитов конкретных абляция в данио рерио по изучению желчных приводом печени Регенерация

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Очищенные визуализации эмбрионального и постнатального Сердца в одноклеточные Разрешение

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Расширение и адипогенез Индукция адипоцитов-предшественников из периваскулярной жировой ткани, изолированной магнитоактивированной сортировкой клеток

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...