Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por beca FKZ 13GW0044 del Ministerio Federal alemán de educación e investigación, proyecto MorphiQuant-3D. Agradecemos a Carolin Bartels para soporte técnico.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

KIT ha recibido reembolsos por Boeckeler Instruments para el suministro de un modelo funcional del soporte del sustrato. Marlene Thaler es empleado de ZEISS microscopio GmbH, fabricante de los sistemas del microscopio mencionados en este artículo. Además, ZEISS ofrece ciertas soluciones como paquetes de soluciones de Atlas de ZEISS para una amplia gama de aplicaciones en proyección de imagen de gran superficie, 3D para instrumentos SEM y FIB-SEM. Otros autores no tienen nada que revelar.

Se demostró un flujo de trabajo para apuntar las células específicas dentro de un tejido por multimodal en jerárquica: una muestra embebido en resina se rebana para arriba en arreglos de discos de secciones seriadas, que se colocan sobre un sustrato conductor de utilizar un sustrato diseñado. Después de etiquetar con un fluoróforo y la proyección de imagen en la FLM, el volumen reconstruido se utiliza para seleccionar las células diana. Después de la coloración adicional rondas con metales pesados para introducir el contraste, estos objetivos son reflejados en varias cientos secciones a nanoescala de resolución en un SEM utilizando una plataforma de software automatizado.
Para la producción de matrices densamente con varias cintas largas, un soporte de sustrato similar a la descrita aquí es necesario. Una persona calificada y paciente puede ser capaz de conectar varias cintas a un sustrato de silicio, semi sumergido en el barco de cuchillo y recuperar la matriz reduciendo gradualmente el nivel de agua hasta que las cintas están sentados sobre el sustrato. Sin embargo, en la nuestra experiencia, existe una tendencia a romper la formación cuando el sustrato está tocando cualquier parte del barco de cuchillo (cf. nota en 1.3.2 en protocolo). Además, este procedimiento es mucho más difícil con sustratos recubiertos de ITO: (1) debido a la transparencia del vidrio de ITO, es difícil ver la orilla del agua donde los extremos de las cintas deben ser Unido; y (2) porque la superficie revestida de ITO es mucho más áspera que la oblea de silicio altamente pulido, las cintas tienden a romperse durante la extracción y pequeños fragmentos de algunas secciones pueden flotar, así destruir el orden de las secciones.
El flujo de trabajo de todo también es factible sin correlación a los datos de la FLM. En este caso, toma de datos en el SEM tenga que realizarse en varias sesiones. Una reconstrucción 3D inicial o por lo menos evaluación de datos de baja o media resolución puede ser necesaria identificar los objetivos. Además, pueden aplicar manchas histológicas convencionales para brightfield LM (no requiriendo FLM). Por supuesto, otras opciones6,7,8 son anticuerpo etiquetado en las matrices, como ya quedó demostrado en el libro inicial en18, genéticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) o la inclusión de etiquetado con la preservación de la fluorescencia durante la preparación de la muestra.
Una limitación general del método discutido es el uso de secciones de un grosor determinado y el muestreo discreto resultante del volumen 3D: resolución en Z sólo puede ser tan bueno como el espesor de las secciones desde el SEM recoge sólo datos de la superficie de la sección (d según la energía primaria energía/aterrizaje seleccionado). Esto significa que el volumen 3D resultante tiene vóxeles anisotrópica, por ej., 5 x 5 x 100 nm3 si 100 secciones de nm y un tamaño de pixel de imagen de 5 nm se utilizan. Para las entidades muy pequeñas en un rango de tamaño por debajo de 1 μm, esto puede no ser suficiente para una verdadera Descripción ultraestructural. Una limitación más técnica es la precisión de la etapa que se utiliza en el SEM para automatizado la proyección de imagen. Debido a esto, es necesario elegir un ROI mayor que las especificaciones de la exactitud de la etapa para garantizar que el área de la blanco completo es reflejado.
En comparación con SBF-SEM y FIB-SEM como métodos de proyección de imagen de bloque cara, correlativos en tiene la desventaja definitiva de vóxeles anisotrópicos, como se describe anteriormente. Con FIB-SEM, vóxeles isótropos de 5 x 5 x 5 nm3 pueden ser obtenido cuando una corrección de deriva adecuado es en el lugar.
Diferencias en el volumen reconstruido debido a la pérdida de las secciones durante la preparación de matrices pueden ser también una preocupación que no se encuentra con SBF-SEM o FIB-SEM. Con estabilización de buena cinta de pegamento, generalmente es sólo un tema para el último tramo de una cinta: pueden dañarse al lanzar desde el filo de la navaja con la pestaña. Sin embargo, en nuestra experiencia, la pérdida de una sección en cada tramos de 20-50 no influyen en registro de la imagen.
Por otro lado, la posibilidad de la mancha matrices confiere buena señal y contraste para la proyección de imagen de SEM, incluso en muestras débil metalizadas tales como la alta presión congelado ápices se muestra a continuación. Por lo tanto, no es necesario comprometer la conservación óptima ultraestructural por fijación química y numerosos pasos de metalización. Además, muestras de rutina del laboratorio de patología con grados intermedios de la metalización de entregan datos excelente10. Tal un realce de contraste la inclusión no es posible para SBF-SEM y FIB-SEM en general. Además, puesto que estos métodos son destructivos, es decir, consumir la muestra durante la proyección de imagen, jerárquico en sitios y diferentes resoluciones de imagen o proyección de imagen repetida en los puntos más adelante en el tiempo es imposible. En principio, volúmenes ilimitados, de gran campo de imagen (por ejemplo, hasta varios milímetros para cerebro de ratón todo en connectomics) crearon por mosaicos de costura, y un gran número de secciones puede ser adquirido por AT, mientras que en el FIB-SEM, campo de imagen más allá de 100 μm μm x 100 son difíciles de alcanzar con instrumentos de rutina.
Más automatización del AT-flujo de trabajo descrito sería una ventaja definitiva, ya que los métodos antes mencionados SBF-SEM y FIB-SEM realizan seccionamiento y la proyección de imagen en el mismo instrumento en una forma totalmente automatizada. Existe un tipo de automatización de la sección: ATUMtome la12 puede generar y recolectar miles de secciones, pero el uso de la cinta del Kapton como un sustrato de tales matrices difíciles de imagen en un FLM. Sobre el cubreobjetos recubierto ITO usado aquí, proyección de imagen de resolución súper incluso debería ser posible. Un objetivo adicional, muy accesible para la automatización sería la grabación de las pilas de datos FLM. Por otro lado, automatización puede ser cara y excepto el soporte del sustrato, el flujo de trabajo presentado aquí (en cuanto a hardware) sólo cuenta con instrumentación generalmente disponible en una rutina EM laboratorio o base, que bajo nivel de acceso.

Para la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido en resolución ultraestructural de los diferentes métodos de proyección de imagen basada en SEM han sido usadas1: exámenes amplios están disponibles por ejemplo., SBF-SEM2, FIB-SEM3y matriz Tomografía (a)4. Mientras que para este último método la muestra del material se conserva como un conjunto de secciones seriadas en un substrato, SBF-SEM y FIB-SEM son métodos destructivos, trabajando en el bloque de muestra y consumirla durante proyección de imagen. Debido a la carga de la resina en el SEM, también dependen fuertemente metalizada muestra bloques5.
Por otra parte, identificar ciertas células o estructuras de interés dentro de una muestra de tejido puede beneficiar particularmente de correlativa luz y microscopia electrónica (CLEM)6,7,8. Utilizando FLM para apuntar excluye la aplicación de grandes cantidades de metales pesados ya que esto sería apagar la señal de la fluorescencia del9. Para dichas muestras ligeramente metalizados único, AT es el método de elección desde matrices pueden ser fácilmente posterior tinción con metales pesados después de la proyección de imagen de LM. Por otra parte, casi cualquier tipo de muestra puede utilizarse para AT, incluso rutinarias muestras desde el patólogo tesoro pecho10.
Otra gran ventaja del AT es el potencial de jerárquico11 o proyección de imagen de resolución múltiple12: no es necesario a la imagen todo en alta resolución, como metas pueden seleccionarse en una modalidad diferente (por ejemplo, FLM) o en baja resolución imágenes de SEM. Sólo las regiones interesantes de una población de tejido o células en alta resolución de imagen ahorra espacio de almacenamiento de datos digitales y produce pequeños conjuntos de datos de la imagen, que son más fáciles de manejar. Aquí, el flujo de trabajo de AT se demuestra utilizando una muestra más bien débil metalizada: alta presión congelados a raíz de la planta (Arabidopsis thaliana) incrustado en resina hidrofílica.
Se explicó cómo los arreglos son preparados, manchados y reflejados en FLM y SEM, y cómo se colocan las pilas de imágenes. Además, se ilustra cómo la reconstrucción 3D del volumen FLM se puede utilizar para seleccionar celdas específicas para la proyección de imagen en el SEM en escala nanométrica resolución.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Dirigidos a células específicas en resolución ultraestructural dentro de una población de mezclado de la célula o un tejido pueden lograrse mediante la proyección de imagen jerárquica utilizando una combinación de luz y microscopia electrónica. Muestras incrustadas en resina son seccionadas en matrices consisten en cintas de cientos de secciones ultrafinas y depositadas sobre trozos de oblea de silicio o cubreobjetos conductively cubierto. Arreglos de discos son imagen en baja resolución usando un consumidor digital como cámara del smartphone o microscopio de luz (LM) para una visión rápida área grande o un microscopio de fluorescencia de campo ancho (fluorescencia microscopía (FLM)) después de etiquetar con fluoróforos. Después de la tinción con metales pesados, arreglos de discos son imagen en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Selección de objetivos es posible de reconstrucciones 3D generadas por FLM o de reconstrucciones 3D hacen de las pilas de imágenes de SEM en resolución intermedia si no hay marcadores fluorescentes están disponibles. Para el análisis ultraestructural, objetivos seleccionados finalmente se registran en el SEM en alta resolución (píxeles de imagen de algunos nanómetros). Se demuestra una herramienta de manejo de la cinta que puede ser adaptada a cualquier ultramicrótomo. Ayuda con matriz producción y eliminación del sustrato desde el barco de cuchilla de seccionamiento. Una plataforma de software que permite la proyección de imagen automatizada de matrices en el SEM se discute. En comparación con otros métodos de generación de datos de gran volumen EM, como la cara de bloque serie SEM (SBF-SEM) o viga de ion enfocada SEM (FIB-SEM), este enfoque tiene dos ventajas importantes: (1) la muestra embebido en resina se conserva, aunque en una versión en rodajas. Puede ser teñido de diferentes maneras y reflejada con diferentes resoluciones. (2) como las secciones pueden ser post-manchadas, no es necesario utilizar muestras fuertemente teñidas de bloque con metales pesados para introducir contraste para la proyección de imagen de SEM o bloques de representación de los tejidos conductores. Esto hace que el método aplicable a una amplia variedad de materiales y cuestiones biológicas. Materiales especialmente con prefijo por ejemplo, de los bancos de la biopsia y laboratorios de patología, puede directamente ser incrustado y reconstruido en 3D.

El flujo de trabajo descrito aquí (figura 1) se inicia con una muestra en un bloque de resina. Durante la preparación de la muestra, algunos metales pesados debe ser introducido en el tejido, pero no es necesario utilizar protocolos optimizados para Encapado de metal algo fuerte. Figura 1A muestra una raíz de la planta (Berro) bloque manchada convencionalmente con 1% OsO4 y 1% acetato de uranilo, mientras que la raíz de Arabidopsis en la figura 1B es solamente débil había metalizado usando 0,5% acetato de uranilo. El tipo de muestra esta última es ideal para acercamientos correlativos como algunos metales pesados tienden a apagar de la fluorescencia. Con un soporte dedicado de sustrato (figura 2), matrices de varias cien secciones pueden ser producido (figura 1). Después de etiquetado fluorescente, tales arreglos son reflejadas en un estándar amplio campo FLM (figura 1), luego teñidas con soluciones de metales pesados y reflejadas en un SEM en diferentes resoluciones (Figura 1E–G).
Herramientas importantes para la generación reproducible de arreglos de discos, particular cuando la coloque varias cintas de barco de cuchilla de micrótomo sobre un sustrato, son el soporte del sustrato (figura 2A, diseñado en laboratorio de los autores) y un diamante de Jumbo cuchillo con un barco lo suficientemente grande para acomodar portaobjetos (figura 2B). Un menisco plano, permitiendo la buena observación de las cintas, es necesario y puede lograrse mediante plasma limpieza del sustrato: una pequeña gota de agua destilada no forman una estructura en forma de lente en el sustrato como en la figura 2 (sustrato), pero una película fina (Figura 2D, sustrato de plasma activada). En estas condiciones, a la parte seca de un cubreobjetos recubierto ITO las cintas son fácilmente visualizada (Figura 2E) y puede ser observado y controlado durante la extracción del sustrato del agua.
Por ejemplo, arreglos de discos de teñidos con ioduro de propidio para etiquetar las paredes celulares de plantas fueron reflejadas con un estándar amplio campo FLM (Figura 3A). Puesto que las secciones son sólo 100 nm de espesor, incluso demasiado tinción como se muestra a continuación presenta poco desenfoque. Después del registro, se seleccionaron las dos células totalmente incluidas en el volumen reconstruido de la pila de la imagen (figura 3B) para la proyección de imagen de alta resolución en 3D (véase también Suplementario S1 de la película). Tras tinción adicional con uranilo acetato, citrato de plomo, los arreglos de discos se reflejada en la SEM. figura 3 C muestra un resumen, con píxeles de imagen de 60 nm; el cuadrado oscuro en el centro de la imagen indica la posición donde ejecutaron a las funciones de enfoque automático, y la dosis adicional condujo a contaminación ligera. Caso de ROIs en esas secciones seriales (rodajas de 51 a 248 de 435 rebanadas en total) que contiene las células de dos destino seleccionadas en la pila de la FLM se registraron entonces con un tamaño de pixel de imagen nm 5 (figura 3D; vea también Suplementario S2 de película).
Automatizado la proyección de imagen jerárquica de las matrices en el SEM se describe aquí se hizo con la solución de la plataforma de software y hardware ZEISS Atlas 5. En primer lugar, un resumen de toda la serie fue creado con el detector SE muy grande (1.000 nm) de la imagen píxeles y tiempo de permanencia muy baja (Figura 4A). Un ROI que sólo el tejido puesto en la primera sección, propaga al resto de las secciones de la matriz. Este conjunto de sección se registró entonces con 60 píxeles de imagen nm utilizando un mayor tiempo de permanencia (Figura 4B). Finalmente, se estableció un sistema de sitio, que contiene las células dos blanco más uno "capa" de alrededor de las células para tener en cuenta la imprecisión de la etapa, con los siguientes parámetros: tiempo de detector de ESB (dispersión de retorno selectivo de energía), imagen de nm 5 píxeles, muy largo (40 μs) Moran ( Figura 4). Zoom a una imagen tan muestra detalle subcelular (figura 4) como las vacuolas (V), mitocondrias (M), núcleo (N) y el retículo endoplasmático (flechas). Vea también el Suplemento S3 película de zoom de un resumen de la matriz de todo al detalle subcelular de una célula diana.
La matriz que se muestra a continuación (200 secciones) más un adicional de 250 secciones tomó alrededor de 8 h para producir, una noche a la mancha para que la LM y un día grabar (manualmente) en la FLM. Post coloración toma aproximadamente 1-2 h en total, dependiendo del número de matrices individuales. Para la grabación de SEM, un par de horas se requiere para configurar el funcionamiento de Atlas, y grabación automatizada fue 3-4 h para el conjunto de sección intermedia de la resolución (tamaño de píxel de 60 nm) (secciones de 200, 450 x 200 μm2) y cerca de 5 días para la alta resolución (5 nm tamaño de píxel) ROI que contiene las células de la dos blanco (200 secciones, 55 x 30 μm2). Tenga en cuenta que debido al bajo contenido en metal de la muestra que se muestra aquí, una muy lenta velocidad de exploración que se utiliza para alcanzar una buena detección de señal a ruido, que implicaba (para los detectores disponibles en la actualidad) un tiempo de permanencia de 40 μs para el ROI de alta resolución.
Hay varios pasos en el flujo de trabajo todo propenso a errores: idealmente deben ser cintas más o menos recto y se coloca en el orden correcto (figura 5A). Sin embargo, se producen a menudo doblado (figura 5B), curvadas (figura 5) o incluso rotos cintas. Esto puede resultar debido a recorte incorrecto (principal y posterior bordes no paralelos) o pegamento no uniformemente aplicada, sino también de una muestra asimétrica o desigual infiltrada. Especialmente molestas son las muestras que contienen componentes muy duros y suaves. Los componentes de este último pueden ser difíciles infiltrarse como la pared celular de las raíces de la planta que se muestra a continuación (figura 5). En ese caso, los pliegues (flecha) fácilmente pueden ser causados por la compresión variable y relajación durante el seccionamiento. Para automatizado de proyección de imagen en el SEM, cintas curvas no son un gran problema, ya que el ROI se puede girar para acomodar la curvatura de la cinta.
Otro paso fundamental en el protocolo es tinción: lavado insuficiente puede dar lugar a residuos en la sección (figura 5E, F) y en el peor de los casos, cubrir el área más interesante (círculo en una de las celdas de dos destino en figura 5F). También, polvo (figura 5, las partículas de la dispersión de la luz fuertemente) introducido en el barco de cuchillo, por ejemplo, con un portador de sustrato sucio, puede causar serios problemas: en la FLM, el polvo puede ser altamente fluorescente (cf. lonchas de película suplementario S1) a tal punto que algunos algoritmos de registro no funcionan. Sin embargo, la función de "alinear" en TrakEM17 puede manejar tantas pilas como se muestra en Suplementario S1 de la película.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo para la proyección de imagen jerárquica correlativo. A partir de una muestra incrustado en un bloque de resina (A, muestra fuertemente metalizada), la muestra es primera recortada (B, muestra débil metalizado) y luego las matrices consisten en varias cintas de secciones seriadas (C), colocado aquí en un Cubreobjetos recubierto ITO, se producen utilizando un ultramicrótomo. Después de la tinción con un colorante fluorescente, montones de imágenes se registran en un amplio campo FLM (D). Después sales de tinción más rondas con metales pesados, pilas se reflejada en un SEM (E–G) en diferentes resoluciones (tamaños de pixel de la imagen). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figura 2: herramientas para la preparación de matrices. Soporte de sustrato montado de micromanipuladores con siete ejes de movimiento conectado a un ultramicrótomo estándar (A): los tornillos, con círculos, son verticales (1) y (2) el movimiento horizontal y de inclinación (3) sustrato portador de la . El cuchillo del diamante enorme con un barco de gran tamaño para dar cabida a grandes sustratos (flecha), aquí con un pedazo de oblea de silicio activado por plasma montado en un portador de aluminio tamaño de diapositiva (B). Gotas de 20 μl de agua destilada colocaron sobre un substrato de la oblea de silicio sin tratar (C) o sobre un sustrato de plasma activada (D). Cuatro cintas flotando en el barco de cuchillo, unido a un cubreobjetos recubierto ITO por sus extremos inferiores. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figura 3: correlación de los datos de LM con SEM datos. Descripciones (A, C) y las células diana (B, D) grabado con FLM (A, B) y SEM (C, D). (B) es un zoom de software y los datos originales se registraron con un objetivo de X 40 sobre un chip de cámara 1.388 x 1.040 píxeles, mientras que (C) se registra con 60 tamaño de pixel de la imagen de nm y (D) con 5 nm píxeles tamaño de la imagen, que ilustra el verdadero aumento de resolución en el SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figura 4: jerárquica de proyección de imagen en el SEM con ZEISS Atlas 5 a Resumen de una matriz grabada con 1.000 píxeles nm usando el detector SE (A). Sección fija con el ROI colocó sobre el tejido en cada sección y registró con píxeles de 60 nm (B). Sitio se establece con un ROI serial colocó en las células diana y registró con píxeles de imagen de 5 nm (C). Cuando utilice el zoom en estas imágenes de alta resolución (D), compartimientos de la membrana intracelular como vacuolas (V), núcleo (N), mitocondrias (M) y el retículo endoplasmático (flechas) se hacen visibles. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figura 5: problemas típicos. 1. derivados del proceso de seccionamiento: cintas a cubreobjetos recubierto ITO son idealmente recta (A), pero irregular compresión durante el seccionamiento pueden causar doblado (B) o cintas curvadas (D) o incluso los pliegues (C). 2. causado por manejo de substrato y cintas en el agua, por ejemplo, durante el seccionamiento y la coloración: luz de dispersión de partículas en el substrato (D), borde de gotitas en sección (círculo en E), o la suciedad manchada hacia fuera sobre tejido debido a la inadecuada lavado después de la tinción (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Suplementario S1 de la película: pila de imagen FLM. 435 imágenes alineación en Fiji16 usando TrakEM17 y guardado como archivo de película (.avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplementario S2 película: pila de imagen SEM. 210 imágenes alinean en Fiji16 usando TrakEM17. La pila original (300 imágenes) de este conjunto de datos fue 15 GB. Para reducir el tamaño de la pila de 3,3 GB (después de la alineación y el cultivo a sólo las dos células de destino), fue escalado en x y y por un factor de 0.2 con Fiji y luego guardado como .avi película. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplemento S3 de película: zoom con niveles de resolución diferentes en el SEM. Película creada en y exportada desde el software de Atlas 5 en formato. MP4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Este protocolo está dirigido a células específicas en el tejido para la proyección de imagen en resolución de nanoescala utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Gran número de secciones seriadas del material biológico embebido en resina es primero reflejada en un microscopio de luz para identificar el destino y luego de manera jerárquica en la SEM.

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...