Name: multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Bu eser grant FKZ 13GW0044 Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma, proje MorphiQuant-3D için desteklenen bir durumdu. Carolin Bartels teknik destek için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

KIT substrat sahibinin işlevsel bir model temini için Boeckeler aygıtlar tarafından geri ödeme aldı. Marlene Thaler ZEISS mikroskobu GmbH, bu makalede belirtilen mikroskop sistemleri üretici çalışandır. Ayrıca, ZEISS SEM ve FIB-SEM Araçları için geniş bir alan, 3D görüntüleme uygulamalarında geniş bir yelpazesi için ZEISS Atlas çözüm paketleri gibi belirli çözümler sunmaktadır. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Bir doku Multi-Modal hiyerarşik AT tarafından içindeki belirli hücreleri hedefleme için bir iş akışı gösterilmiştir: reçine gömülü bir örnek, bir özel tasarlanmış substrat tutucu kullanarak iletken bir substrat yerleştirilen seri kesitler, bir dizi içine doğradı. Bir fluorophore ile etiketleme ve FLM görüntüleme sonra yeniden oluşturulan birim hedef hücreleri seçmek için kullanılır. Ek boyama ağır metaller ile kontrast tanıtmak için tur sonra bu hedefleri bir SEM bir otomatik yazılım platformu kullanarak Nano çözünürlükte birkaç yüz bölüm üzerinde görüntüsü.
Birkaç uzun şeritler yoğun dolu diziler üretmek için burada açıklanan benzer bir substrat tutucu gereklidir. Yetenekli ve sabırlı kişi birkaç şeritler bıçak tekne yarı dalmış bir silikon yüzey ekleyin ve kurdeleler yüzey üzerinde oturuyorsun kadar yavaş yavaş su seviyesini düşürerek dizi almak mümkün olabilir. Ancak, bizim deneyim ne zaman belgili tanımlık substrate bıçak tekne (1.3.2 protokolündeki cf. Not) herhangi bir bölümünü dokunuyor oluşumu paramparça için bir eğilim vardır. Buna ek olarak, bu yordam ITO kaplı yüzeyler ile çok daha zor olacaktır: (1) ITO-cam şeffaflık nedeniyle su kenarı kurdele uçlarını iliştirilecek; olduğu görmek zordur ve (2) ITO kaplı yüzey çok parlak silikon gofret kadar kaba olduğu için kurdeleler bölümlerin sırasını böylece yok edip Asansör-out ve birkaç bölümden oluşan daha küçük parçaları savrulabilirsırasında kırmak eğilimindedir.
Tüm iş akışı da korelasyon FLM veri olmadan mümkün olabilir. Bu durumda, veri toplama SEM içinde çeşitli oturumlarda yapılması gerekebilir. İlk 3D yeniden yapılandırma ya da en azından düşük veya orta çözünürlükte veri değerlendirme hedefleri tanımlamak gerekli olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan LM için geleneksel histolojik lekeleri (değil gerektiren FLM) uygulanabilir. Zaten18, ilk kağıt üzerinde gösterdiği gibi diziler üzerinde etiketleme veya genetik olarak flüoresan proteinleri (XFPs) kodlanmış veya etiketleme önceden katıştırma antikor are-in yön, diğer seçenekleri6,7,8 Floresans numune hazırlama sırasında korunması ile.
Belirli bir kalınlık bölümlerini ve 3B cilt elde edilen ayrık örnekleme kullanımı genel kısıtlamasıdır tartışılan yöntem: Z de çözüm sadece olabilir bölümleri kalınlık olarak iyi SEM tek veri bölümü yüzeyden (d toplar bu yana epending Seçili birincil enerji/açılış enerji). Bu elde edilen 3B cilt Anizotropik voxels, e.golduğu anlamına gelir., 5 x 5 x 100 nm3 Eğer 100 nm bölümleri ve bir görüntü piksel boyutu 5 nm kullanılır. Bir boyut aralığı 1 µm aşağıda çok küçük varlıklar için bu gerçek bir ultrastructural açıklama için yeterli olmayabilir. SEM Imaging otomatik için kullanılan sahne doğruluğunu daha teknik bir kısıtlamadır. Bu nedenle, tam hedef alan görüntüsü güvence altına almak için bir yatırım Getirisi daha büyük sahne doğruluk özellikleri seçmek gereklidir.
SBF-SEM ve FIB-SEM blok suratlı görüntüleme yöntemleri olarak göre Bağdaşık Anizotropik voxels, yukarıda açıklandığı gibi kesin bir dezavantajı vardır. Ne zaman uygun drift düzeltme yer FIB-SEM ile 5 x 5 x 5 nm3 izotropik voxels elde edilebilir.
Yeniden oluşturulan birimin bölümler diziler hazırlanması sırasında kaybı nedeniyle boşluklar da SBF-SEM veya FIB-SEM ile karşılaştı değil bir endişe olabilir Tutkal tarafından iyi şerit stabilization ile bu genellikle sadece bir Şerit'in son bölümü için bir sorun: ne zaman serbest bırakmak o kirpik kullanarak knife-edge hasar görmüş. Ancak, deneyim, her 20 – 50 bölümlerde bir bölümünün kaybı görüntü kayıt etkilemez.
Öte yandan, diziler sonrası leke imkanı iyi sinyal ve kontrast için kök ipuçları burada gösterilen donmuş yüksek basınç gibi zayıf metalize örnekleri üzerinde bile SEM düşsel confers. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal fiksasyonu ve metallization adımları tarafından en iyi ultrastructural korunması tehlikeye gerek yoktur. Ayrıca, orta derece metallization olan patoloji laboratuarından rutin örnekleri mükemmel veri10teslim. Sonrası gömme kontrast geliştirme genel olarak SBF-SEM ve FIB-SEM için mümkün değildir. Bu yöntemler yıkıcı olduğundan, Ayrıca, Yani, örnek görüntü, farklı çözünürlüklerde ve siteleri görüntüleme hiyerarşik veya zaman içinde daha sonra noktalarda tekrarlanan görüntüleme sırasında tüketmek mümkün değildir. Prensip olarak, sınırsız birim, büyük FOVs (örneğin, connectomics tüm fare beyinlerinde için birkaç milimetre kadar) oluşan mozaikler dikiş tarafından oluşturulan ve bölümler çok büyük sayılara AT, FIB-SEM iken, FOVs 100 µm x 100 µm ötesinde tarafından elde edilebilir rutin araçlarıyla ulaşmak zordur.
Yukarıda belirtilen yöntem SBF-SEM ve FIB-SEM hem kesit ve tam otomatik bir şekilde aynı araç içinde görüntüleme gerçekleştirmek daha fazla otomasyon iş akışının açıklandığı AT-bir avantaj olacaktır. Otomasyon kesit, bir tür var: ATUMtome12 oluşturmak ve bölümler binlerce toplamak, ama böyle bir substrat yapar gibi Kapton Teyp kullanımını zor bir FLM görüntüde diziler. ITO kaplı coverslips burada kullanılan üzerinde bile süper kararlılık düşsel mümkün. Otomasyon için daha fazla, çok istenen hedef FLM veri yığınları kayıt olurdu. Öte yandan, otomasyon pahalı olabilir ve substrat sahibi dışında burada sunulan iş akışı (donanım açısından) sadece araçları düşük yapma bir rutin EM laboratuvar veya çekirdek tesis, genellikle mevcut dayanan düzey erişim.

Doku ultrastructural çözünürlükte geniş hacimli yeniden inşa için SEM dayalı farklı görüntüleme yaklaşımlar bir dizi olmuştur kullanılan1: kapsamlı değerlendirmeleri vardır kullanılabilir örn., SBF-SEM2, FIB-SEM3ve dizi Tomografi (AT)4. İkinci yöntem için örnek malzeme seri bir substrat bölümlerde dizisi olarak korunur, SBF-SEM ve FIB-SEM yıkıcı yöntemleri, örnek blokta çalışma ve görüntüleme sırasında alıcı iken. SEM reçine şarj nedeniyle, onlar da şiddetle metalize örnek blok5üzerinde bağlıdır.
Öte yandan, belirli hücreleri veya doku örneği içinde faiz yapılarının belirlenmesi özellikle Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)6,7,8yararlanabilirsiniz. Bu floresan sinyal9gidermek beri FLM için hedefleme kullanarak uygulama heavy metal büyük miktarda engellemektedir. Diziler LM görüntüleme sonra kolayca sonrası heavy metal ile lekeli olabilir beri böyle sadece biraz metalize örnekleri için AT yönteminin seçimi var. Ayrıca, hemen hemen her örnek türü için kullanılabilir, patolog'ın bile rutin örnekleri göğüs10hazine.
AT bir diğer büyük avantajı hiyerarşik11 veya çoklu çözünürlük görüntüleme12için potansiyel mevcuttur: her şeyde yüksek çözünürlüklü görüntü gerek yoktur, hedefleri farklı bir yöntem (örneğin, FLM) ya da seçilebilir düşük çözünürlüklü SEM görüntüleri. Sadece ilginç bölgeleri, yüksek çözünürlüklü bir doku veya hücre nüfusunun görüntüleme dijital veri depolama alanı kaydeder ve kolay olan daha küçük görüntü veri kümeleri üretir. Burada, oldukça zayıf metalize bir örnek kullanarak AT iş akışı gösterilmiştir: yüksek basınç bitki kökleri (Arabidopsis thaliana) dondurulmuş gömülü hidrofilik reçine.
Diziler hazırlanan, lekeli ve FLM ve SEM görüntüsü ve görüntü yığınları kayıtlı nasıl açıklanmıştır. Ayrıca, FLM birim 3D yeniden inşası SEM Nano çözünürlükte görüntüleme için belirli hücreleri seçmek için nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

Bir karma hücre grubun veya bir doku içinde ultrastructural çözünürlükte belirli hücreleri hedefleme bir ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hiyerarşik görüntüleme tarafından elde edilebilir. Reçine gömülü örnekleri ultrathin bölümleri yüzlerce kurdela oluşan diziye kesitli ve silikon gofret veya conductively kaplı coverslips parçaları yatırılır. Dizileri düşük çözünürlükte bir dijital tüketici smartphone kamera veya hızlı geniş alanı genel bakış için ışık mikroskobu (LM) veya geniş alan floresan mikroskop (Floresan ışık mikroskobu (FLM)) gibi fluorophores ile etiketleme sonra kullanarak yansıma. Ağır metaller ile sonrası sonra boyama, diziler bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü. Hedeflerin seçimi 3D rekonstrüksiyonlar FLM tarafından oluşturulan veya floresan hiçbir işaretleri yoksa SEM görüntü yığınları orta çözünürlükte yapılmış 3D rekonstrüksiyonlar mümkündür. Ultrastructural analiz için seçilen hedefleri sonunda yüksek çözünürlüklü, SEM kaydedilir (bir kaç nanometre görüntü piksel). Herhangi bir ultramicrotome için güçlendirilmiş bir şerit işleme aracı gösterilmiştir. Bu dizi üretim ve parça bıçak tekne substrat kaldırılması ile yardımcı olur. SEM dizilerin otomatik görüntüleme sağlayan bir yazılım platformu ele alınmıştır. Seri blok-yüz SEM (SBF-SEM) veya odaklı iyon demeti SEM (FIB-SEM), gibi büyük hacimli EM verileri oluşturan diğer yöntemlere göre bu yaklaşım iki önemli yararı vardır: (1) reçine gömülü örnek, dilimlenmiş-up versiyonu da olsa korunmuş. Farklı şekillerde lekeli ve farklı çözümler sunarak görüntüsü. (2) gibi bölümler sonrası Boyanabilen, kontrast için SEM düşsel tanıtmak veya doku blok iletken işlemek için ağır metaller ile örnekleri güçlü blok lekeli kullanmak gerekli değildir. Bu yöntem çok çeşitli malzeme ve biyolojik sorular için geçerli hale getirir. Özellikle önekli malzemeler örneğin, biyopsi bankalar ve patoloji laboratuarları, doğrudan olabilir gömülü ve 3D yeniden.

İş akışı (Resim 1) başlar bir reçine blok içinde gömülü bir örnek ile burada açıklanan. Numune Hazırlama sırasında bazı ağır metal dokusu içine tanıttı olabilir, ama oldukça güçlü metallization için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı kullanmak üzere gerekli değildir. Şekil 1A bitki kök (tere) blok standart olarak %1 OsO4 ile lekeli ve % 0.5 uranyl asetat kullanarak şekil 1B Arabidopsis kökte sadece zayıf ise % 1 uranyl asetat, metalize gösterir. Bazı ağır metallerin Floresans gidermek eğilimi olarak ikinci örnek türü Bağdaşık yaklaşımlar için uygundur. Bir adanmış substrat tutucu (Şekil 2) ile birkaç yüz bölümleri bir dizi olabilir (şekil 1 c) üretilen. Floresan etiketlemeyi sonra böyle diziler bir standart geniş alanlı FLM (şekil 1 d), yansıma sonra ağır metal çözümleri ile lekeli ve farklı çözünürlüklerde (şekil 1E-G) bir SEM görüntüsü.
Önemli diziler, tekrarlanabilir nesil için özellikle birkaç şeritler bir substrat üzerine microtome'nın bıçak tekneden yerleştirirken substrat tutucu (şekil 2A,) yazarın laboratuvarda özel olarak tasarlanmış ve bir Jumbo elmas araçlardır bir tekne mikroskop slaytlar (2B rakam) kapsayacak kadar büyük bıçak. Düz bir Menisküs, şerit, iyi gözlem izin gereklidir ve belgili tanımlık substrate plazma Temizleme tarafından elde edilebilir: distile su küçük damlacık bir objektif benzeri yapıda olduğu gibi şekil 2C (tedavi edilmemiş substrat), substrat üzerine oluşturması gerektiğini değil Ama ince bir film (2D rakam, aktif plazma yüzey). Bu koşullar altında kolayca bir ITO kaplı coverslip kuru bölümüne bağlı şeritler vardır (şekil 2E) görüntülenir ve gözlenen ve Asansör-dışarı-in belgili tanımlık substrate su sırasında kontrol.
Örneğin, standart geniş alan FLM (şekil 3A) ile bitki hücre duvarları etiketlemek için propidium iyodür ile lekeli diziler görüntüsü. Bölümleri yalnızca 100 olduğundan kalın, hatta burada gösterildiği gibi aşırı boyama nm tanıttı biraz bulanık. Kayıt olduktan sonra tamamen restore edilmiş hacmindeki kapalı iki hücre için yüksek çözünürlüklü düşsel 3D görüntü yığını (şekil 3B) üzerinden seçildi (Ayrıca bkz: Tamamlayıcı film S1). Ek uranyl asetat ve kurşun sitrat ile boyama ardından dizileri görüntüsü SEM'de 3 C rakam 60 nm görüntü piksel; kaydedilen genel bir bakış, gösterir Resmin merkezine karanlık meydanda nerede otofokus işlevleri idam edildi ve ek doz için hafif kirlenme yol konumunu gösterir. Uygun ROIs bu seri bölümler (dilim 51-248 435 dilimleri toplam) içinde FLM yığın içinde seçilen iki hedef hücreleri içeren bir 5 nm görüntü piksel boyutu ile sonra kaydedildi (şekil 3D; Ayrıca Tamamlayıcı film S2bakınız).
Burada açıklanan SEM dizide otomatik hiyerarşik görüntüleme yazılım/donanım platformu çözüm ZEISS Atlas 5 ile yapıldı. İlk olarak, Bütün dizi genel bir bakış ile SE dedektörü kullanılarak oluşturulmuş çok büyük (1.000 nm) görüntü piksel ve çok düşük Işınma Zamanı (şekil 4A). Sadece doku özetleyen bir yatırım Getirisi için dizinin tüm diğer bölümleri bulaşan ve ilk bölümüne yerleştirilir. Bu bölümde set sonra uzun bekleme süresi (4B rakam) kullanarak 60 nm görüntü piksel ile kaydedildi. Son olarak, iki hedef hücreleri artı bir "sahne yanlışlık için hesap için hücreleri çevreleyen tabaka" içeren bir site küme aşağıdaki parametrelerle kuruldu: ESB (enerji seçici Backscatter) dedektörü, 5 nm görüntü piksel, çok uzun (40 µs) durmak zaman ( Şekil 4 c). Böyle bir görüntüye zum hücre altı detay (şekil 4 d) boşluklar (V), mitokondri (M), çekirdek (N) ve endoplazmik retikulum (oklar) gibi gösterir. Ayrıca bir hedef hücre hücre altı en ayrıntısına kadar bütün dizi bir bakış yakınlaştırma için Tamamlayıcı film S3 bakın.
Burada (200 bölümler) gösterilen dizi artı bir ek 250 bölümlerden birini üretmek için yaklaşık 8 h aldı, LM (el ile) FLM kaydetmek ve bir gün için leke için bir gece. Boyama sonrası yaklaşık 1-2 h toplam bireysel diziler sayısına bağlı olarak alır. SEM kayıt için bir kaç saat Atlas koşmak ayarlamak için gerekli ve otomatik kayıt oldu 3-4 h orta çözünürlük (60 nm piksel boyut) bölüm kümesinin (200 bölümleri, 450 x 200 µm2) ve yaklaşık 5 gün yüksek çözünürlüklü (5 nm piksel boyutu) için yatırım Getirisi iki hedef hücreleri (200 bölümleri, 55 x 30 µm2) içeren. Burada gösterilen örnek düşük metal içeriği nedeniyle, çok yavaş bir tarama hızı (belgili tanımlık şimdiki elde edilebilir bulmak için) bir bekleme süresi 40 µs, yüksek çözünürlüklü yatırım Getirisi için örtük bir iyi sinyal-gürültü algılama erişmek için kullanılan gerektiğini unutmayın.
Birkaç adım vardır tüm iş akışında tuzaklar için eğilimli: ideal şeritler az ya da düz ve doğru sırada (5A rakam) yerleştirilmiş olmalıdır. Ancak, bent (şekil 5B), eğri (şekil 5 d) ya da kırık şeritler kez üretilmektedir. Bu yanlış düzeltme (önde gelen ve firar kenarları tam olarak paralel) veya non-birörnek uygulanan yapışkan nedeniyle, aynı zamanda asimetrik ya da düzensiz infiltre örneği neden olabilir. Özellikle zahmetli olduğu çok sert ve yumuşak olan bileşenleri. İkinci bileşenleri (şekil 5C) burada gösterilen bitki kökleri gibi hücre duvarına sızmak zor olabilir. Bu durumda, kıvrımlar (ok uçları) kolayca değişken sıkıştırma ve gevşeme kesit sırasında neden olabilir. ROIs şerit eğriliği karşılamak için döndürülebilir beri SEM Imaging otomatik için kıvrımlı şeritler, büyük bir sorun değildir.
Başka bir önemli adım protokolündeki boyama: yetersiz yıkama yol kalıntıları bölümüne (şekil 5E, F) ve en kötü durumda en ilginç alanı ( şekil 5Fiki hedef hücrelerde birini yuvarlağına) kapsamaktadır. Ayrıca, bıçak tekne içine, örneğin, bir kirli substrat taşıyıcı ile tanıtılan toz (şekil 5 d, güçlü ışık saçılma parçacıklar) ciddi sorunlara neden olabilir: FLM, toz-ebilmek var olmak son derece floresan (bkz bazı dilimler halinde tamamlayıcı film. S1) bazı kayıt algoritmalar fonksiyonu için böyle bir ölçüde. TrakEM17 "align" işlevinde ancak, Tamamlayıcı film S1içinde gösterildiği gibi yığınlar işleyebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı için Bağdaşık hiyerarşik düşsel. Bir örnek başlayan katıştırılmış bir reçine bloğunda (A, güçlü metalize örnek), örnek ilk kesilmiş (B, zayıf metalize örnek) ve sonra diziler seri bölümler (C) birkaç kurdela oluşan, buraya yerleştirilen bir Coverslip, ITO kaplı bir ultramicrotome kullanılarak üretilmektedir. Bir floresan boya boyama sonra yığınları görüntülerin bir geniş alanlı FLM (D) kaydedilir. Sonra daha fazla mermi ağır metal boyama tuzlar, yığınlar farklı çözünürlüklerde (görüntü piksel boyutları) bir SEM (E-G) görüntüsü. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Şekil 2: diziler hazırlanması için araçları. Substrat tutucu bir standart ultramicrotome(a)bağlı dolaşım yedi eksenli micromanipulators monte: dikey (1) ve yatay (2) hız ve substrat taşıyıcı (3), devirme vurgulanmış olan daireler, vidalar, yöneliktir . Geniş yüzeylerde (ok), burada bir slayt ölçekli alüminyum taşıyıcı (B) monte edilmiş plazma-harekete geçirmek silikon gofret bir parçası ile karşılamak için büyük boy bir tekne ile jumbo elmas bıçak. 20 µL distile su damlaları bir plazma-harekete geçirmek substrat (D) üstünde ya da bir tedavi edilmezse silikon gofret substrat (C) üzerine yerleştirilir. Dört şerit ITO kaplı bir coverslip alt amaçları tarafından bağlı bıçak tekne yüzer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Şekil 3: SEM verilerle LM veri korelasyon. Genel bakışlar (A, C) ve hedef hücreler (B, D) kaydedilen FLM (A, B) ve SEM (C, D). (B) bir yazılım zoom ve (C) 60 nm görüntü piksel boyutu ve (D) ile kaydedilir iken özgün veri bir 1,388 x 1,040 piksel kamera yonga üzerinde 40 X objektif lens ile gerçek gösteren 5 nm görüntü piksel boyutu ile kaydedildi SEM çözünürlük artışı <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Şekil 4: hiyerarşik ZEISS Atlas 5 AT. kullanarak SEM görüntüleme Bir dizi genel bakış ile 1.000 nm Görüntü piksellerini SE dedektörü(a)kullanarak kaydetti. Doku her bölümünde yerleştirilir ve 60 nm görüntü piksel (B) ile kaydedilen yatırım Getirisi ile bölümü ayarlar. Hedef hücrelere yerleştirilir ve 5 nm görüntü piksel (C) ile kaydedilen bir seri yatırım Getirisi ile site belirler. Böyle yüksek çözünürlüklü görüntü (D) içine zum yapıldığında, hücre içi membran bölmeleri boşluklar (V), çekirdek (N), mitokondri (M) ve endoplazmik retikulum (oklar) gibi görünür hale gelir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Şekil 5: tipik sorunlar. 1. parça işleminden doğan: kesit sırasında coverslips ITO kaplı olan ideal düz(a)ama düzensiz sıkıştırma yerleştirilen şeritler bent (B) veya kıvrımlı şeritler (D) veya hatta kıvrımlar (C) neden olabilir. 2. neden substrat ve kurdeleler su, örneğin, kesit ve boyama sırasında işleyerek: ışık parçacıkları substrat (D) saçılma, RIM damlacıkları bölümü ( Eçemberde) veya kir bulaşmış dışarı nedeniyle yetersiz doku üzerinde (F) Boyama sonra yıkama. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S1: FLM görüntü yığını. 435 görüntüleri TrakEM17 kullanarak Fiji16 ' hizaladım ve film dosyası (.avi) olarak kaydedilmiş. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S2: SEM görüntü yığını. 210 fotoğraf TrakEM17kullanarak Fiji16 ' uyumlu. Bu veri kümesinin özgün yığını (300 fotoğraf) 15 GB oldu. (Hizalama ve sadece iki hücre hedef için kırpma sonrası) 3,3 GB yığından küçültülmesi için o x ölçekli ve y 0.2 bir faktörle Fiji kullanarak ve sonra .avi film kaydedilir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film S3: SEM seviyelerinde farklı çözünürlük ile yakınlaştırma Film içinde oluşturulan ve .mp4 biçiminde Atlas 5 yazılım ihraç. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes at JoVE.com

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk görüntüsü

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...