Name: characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00
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Die folgenden Verfahren wurden von der Tier-Ethik-Kommission an der Monash Universität genehmigt. Gesunde Neugeborene unbehandelten C57Bl6/J P3-6 Mäuse wurden verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren.
(1) enzymatische Verdauung
Hinweis: Es ist wichtig zu überlegen, Sterilität bei der Isolierung und Kultivierung von Primärzellen. Während sicherstellen, dass die Umwelt so steril wie möglich ist, können die ersten Dissektion und Ernte der murine Geh...

<ol>
	<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances+(Report).">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report).</a> Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).</li><li>Saliba, E., Henrot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Mediators+and+Neonatal+Brain+Damage.">Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage.</a> Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).</li><li>Uwe-Karsten, H., Helmut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).</li><li>Cherry, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+multipotent+adult+progenitor+cell+therapy+attenuates+activated+microglial/macrophage+response+and+improves+spatial+learning+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury.</a> Stem cells translational medicine. 2, (2013).</li><li>Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthetic+triterpenoid+CDDO-methyl+ester+modulates+microglial+activities,+inhibits+TNF+production,+and+provides+dopaminergic+neuroprotection.">The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection.</a> Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).</li><li>Gr&#252;tzkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+but+mighty:+How+the+MACS&#174;-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years.">Small but mighty: How the MACS&#174;-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. 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Mikroglia haben die Möglichkeit, pro- und Anti-inflammatory, werden durch Reize der Umgebung verändert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Modulation der Mikroglia-Aktivierung Neuroprotektion verleihen kann. Ihre Fähigkeit zur Gewährung von Schutz für Neuronen und Verletzungen zu reparieren erfordert mehr Forschung, um das aktuelle Verständnis dieser komplexen Zellen zu fördern. Somit ist die Isolierung von hoher Reinheit primären Mikroglia eine wichtige und nützliche Technik. Dies ist eine relativ schnell...

Schäden, die während der Perinatalperiode von Entzündungen, hypoxische Ischämie und Blutungen kann ein Array von langfristig Folgeerscheinungen haben. Die komplexen Pathophysiologie der perinatalen Hirnschädigung ist die Theorie, Entzündungen und Ischämie mit daraus resultierenden neuronalen und axonalen Tod1einzubeziehen. Die angeborene Immunantwort spielt eine wichtige Rolle in der Kaskade von Ereignissen führen zu Verletzungen2.
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS), sind die first Responder auf Verletzungen3. Mikroglia sind Kunststoff Zelltypen mit einer Kapazität von Schutz- oder giftig, abhängig von der Umgebung4sein. Sie engagieren sich in der Produktion von Zytokinen und reaktive Sauerstoff Spezies4,5, Chemotaxis, Phagozytose und Antigenpräsentation. Alternde Mikroglia ständig Umfrage Umwelt und sind durch die Anwesenheit eines fremden oder schädliche Substanz4aktiviert. Aktivierung führt zu einer Pro-inflammatorischen Reaktion, kritische CNS Schutz4. Diese M1 "Pro-inflammatorischen" Phänotyp Mikroglia sind in erster Linie Antigenpräsentation und Tod von Krankheitserregern4beteiligt. Trotz der wichtigen Rolle der Entzündungsreaktion in Neuroprotektion kann unkontrollierte oder längerer Entzündung schädlich und führen zu einer neuronalen Schaden4sein. Jedoch kann bestimmte Reize aus der Umwelt ausgesetzt, Mikroglia eine entzündungshemmende Phänotyp aufweisen. Diese Pro-reparative M2 Mikroglia haben eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung und reparieren6, veröffentlicht eine Reihe von Zytokinen und anderen löslichen Mediatoren, dass Downregulate Entzündung, Phagozytose zu erhöhen und fördern Reparatur4, 7. die Rolle der Mikroglia sind vielfältig und umfassen treibende Oligodendrozyt Differenzierung während Re-Myelinisierung8, Neuronen während Sauerstoff und Glukose Erschöpfung in Takt Modelle9 Schutz und Förderung der Neurit Auswuchs in Verletzung des Rückenmarks Modelle10.
Die Studie von diese Gliazellen ist einen wichtigen Aspekt beim Verständnis und bei die Reaktion auf Neuroinflammation zu manipulieren. Das beschriebene Protokoll kann zur weiteren Untersuchung in das therapeutische Potenzial der Mikroglia Modulation in schwere Erkrankungen.
Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung auf eine neuroprotektive Rolle ist in einer Reihe von Bedingungen11,12,13beobachtet worden. Verbesserung der aktuellen Verständnis und weiter studieren Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist kritisch, die den Einsatz von verschiedenen Modellen, darunter sowohl in Vitro und in Vivo. In-vitro- Studien sind ein wichtiges Instrument durch größere Effizienz, niedrigere Kosten und Fähigkeit zu eine isolierten Zellenbevölkerung zu untersuchen.
Es gibt eine Reihe von Protokollen beschrieben in der Literatur für die Isolierung von Microglia von murinen Gehirne, die Herausforderung, eine high-Yield-Probe mit guter Wirtschaftlichkeit und hoher Reinheit effizient zu produzieren. Häufig verwendete Methoden der Isolierung des primären Mikroglia sind durch magnetische Trennung und längeren schütteln von Gliazellen Mischkulturen. Durch persönliche Erfahrung wurde festgestellt, dass gab es ein hohes Maß an Zelltrümmer die magnetische Spalte behindert. So wurde das folgende Protokoll verwendet, die enthält eine Anfangsdichte gradient Zentrifugationsschritt gefolgt von CD11b magnetische Trennung. Die nachfolgend beschriebene Protokoll wurde optimiert, um eine hochreine Probe in ausreichender Menge zu produzieren. Aufgrund seiner hohen Reinheit und die kurze Zeit vorteilhaft ist — man kann Assays innerhalb von 2 Tagen auszuführen, ohne Kultur für ca. 2-3 Wochen. Dieses Protokoll kann potenziell für die Isolierung von primären murinen Astrozyten angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn, sind die first Responder, Entzündungen oder Verletzungen in das zentrale Nervensystem. Neuere Forschungen haben Mikroglia, dynamisch, fähig, Pro-inflammatorische und Anti-inflammatory Phänotypen gezeigt. (Pro-inflammatorischen) M1 und M2 (Pro-reparative) Phänotypen spielen eine wichtige Rolle in schwere Erkrankungen wie perinatale Hirnschädigung und Ausstellung unterschiedliche in Reaktion auf bestimmte Reize aus der Umwelt Funktionen. Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung wurde festgestellt, Neuroprotektion hindeutet, Mikroglia therapeutisches Potenzial im Hirn-Trauma haben zu verleihen. Jedoch mehr Forschung ist erforderlich, um die Rolle der Mikroglia bei der Krankheit besser zu verstehen, und dieses Protokoll ermöglicht. Das Protokoll beschriebenen verbindet einen Dichte Steigung Zentrifugierung Prozess zur Reduzierung Zelltrümmer, magnetische Trennung, Herstellung von hochreinen Probe von primären Mikroglia-Zellen, die für in-vitro- Experimente, ohne verwendet werden kann die für 2-3 Wochen Kultivierung benötigen. Darüber hinaus ergeben die Charakterisierung Schritte robuste Funktionsdaten über Mikroglia, Studien, unser Verständnis von der Polarisation besser helfen und Grundieren dieser Zellen, die starke Auswirkungen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin hat.

Mit den beschriebenen Methoden hier reine Bevölkerungen der Mikroglia können isoliert werden und können zur Charakterisierung mittels in-vitro- und FACS Analyse vorbereitet werden. Zunächst einmal können bis zu 18 Tiere pro Keulung, mit eine erwartete Rendite von ca. 450.000-600.000 Mikroglia-Zellen verwendet werden. Es ist wichtig, die Reinheit der isolierten Zellen zuerst bestätigen, und dazu FACS Analyse durchgeführt wurde, durch Färbung für die beiden Marker CD45 und...

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...