Name: characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00
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Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.
1. enzimática digestão
Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros muri...

<ol>
	<li>Volpe, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+effects+causing+either+neurotoxicity+or+regeneration+in+the+injured+mouse+spinal+cord.">Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptors+drive+a+phospholipase+C/IP3+pathway+and+modulate+the+cell+activation+toward+a+neuroprotective+role.">Microglial &#945;7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role.</a> Journal of neuroscience research. 83, (2006).</li><li>Bedi, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+multipotent+adult+progenitor+cell+therapy+attenuates+activated+microglial/macrophage+response+and+improves+spatial+learning+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury.</a> Stem cells translational medicine. 2, (2013).</li><li>Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthetic+triterpenoid+CDDO-methyl+ester+modulates+microglial+activities,+inhibits+TNF+production,+and+provides+dopaminergic+neuroprotection.">The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection.</a> Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).</li><li>Gr&#252;tzkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+but+mighty:+How+the+MACS&#174;-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years.">Small but mighty: How the MACS&#174;-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. 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Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamen...

Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal1complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão2.
Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão3. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, dependente do ambiente4. Eles estão envolvidos na quimiotaxia, fagocitose, apresentação de antigénios e produção de citocinas e de4,de espécies reativas de oxigênio5. Microglia senescente constantemente pesquisa o ambiente e são ativados pela presença de uma substância estrangeira ou prejudiciais4. Ativação leva a uma resposta pró-inflamatória, crítica no CNS proteção4. Estes M1 "pro-inflamatórios" fenótipo microglia são principalmente envolvida na apresentação de antigénios e a morte de patógenos4. Apesar do papel crucial da resposta inflamatória na neuroproteção, inflamação descontrolada ou prolongada pode ser prejudicial e levar a dano neuronal4. No entanto, quando expostos a certos estímulos ambientais, microglia pode apresentar um fenótipo anti-inflamatórios. Estes pro-reparativa M2 microglia têm um papel fundamental na cicatrização de feridas e reparação6, liberando uma variedade de citocinas e outros mediadores solúveis que downregulate inflamação, aumentam a fagocitose e promovem reparo4, 7. os papéis de micróglia são diversos e incluem condução diferenciação oligodendrocyte durante re-mielinização8, protegendo os neurônios durante a depleção de oxigênio e glicose em curso modelos9 e promovendo o axônio consequência em 10modelos de lesão da medula espinhal.
O estudo destas células gliais representa um aspecto importante na compreensão e manipulando a resposta ao neuroinflammation. O protocolo descrito permite ainda mais a investigação sobre o potencial terapêutico de micróglia modulação em desordens MPTP.
A modulação da ativação microglial para um papel neuroprotetor tem sido observada em uma variedade de condições11,12,13. Assim, melhorar o entendimento atual e ainda mais, estudando modulação da ativação microglial é fundamental, exigindo o uso de vários modelos, incluindo tanto em vitro como em vivo. Estudos in vitro representam uma ferramenta importante devido à sua maior eficiência, menor custo e capacidade para investigar uma população de células isoladas.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia do cérebro murino, o desafio de produzir com eficiência uma amostra de alto rendimento com boa viabilidade e pureza elevada. Métodos comumente utilizados de isolamento primário microglia são por separação magnética e agitação prolongada das culturas gliais mistas. Através da experiência pessoal, verificou-se que havia um alto grau de restos celulares que obstruiu a coluna magnética. Assim, foi utilizado o seguinte protocolo, que incorpora uma etapa de centrifugação gradiente de densidade inicial seguida de CD11b separação magnética. O protocolo descrito abaixo foi otimizado para produzir uma amostra altamente pura em quantidade suficiente. É vantajoso devido à sua alta pureza e o curto período de tempo — um pode realizar ensaios dentro de 2 dias sem a necessidade de cultura para 2-3 semanas. Este protocolo potencialmente pode ser adaptado para o isolamento de astrócitos murino primários.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.

Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da mi...

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurociência

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...