Name: detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00
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著者編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。

プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
注: この手順はひと新鮮凍結組織 cDNA 分子の数が少ないを検出するため設計します。以前に検証済みの患者由来の胃腫瘍や正常組織サンプルから、まだ凍結中、ドライアイス、ティッシュ セクションをカットされています。
1. RNA の分離及び精製
<ol><li>
RNA の抽出 ?...

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li><li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Assays+Part+I:+Partitioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics.">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li><li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR:+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia.">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li><li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR.">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

dPCR は、DNA 分子測定10、11,12,13マイクロ Rna、RNA 転写産物5の定量化のためのこの技術は適応時間にもともと開発されました 14,15。このプロトコルでは、新鮮凍結組織サンプルから派生したまれな転写産物の検出機能を搭載する?...

CDH1遺伝子は、E-カドヘリン、細胞接着、生存、増殖、および移行1の規制による正常胃上皮の維持に関与する重要な要因のエンコードします。有害な生殖の結果として E-カドヘリン蛋白質の損失またはCDH1の身体の変化は、GC2,3の開発に関連付けられています。2 遺伝子のイントロンから生じる非正規議事録では、胃癌4、5の役割を果たすこともという仮説を立てた。特に、このようなコピーは、 CDH1a、GC セルラインで表現が示されているにはない通常胃4から。最近 GC 組織サンプル チップ ベースの dPCR5を使用して GC 患者からCDH1aを検出しました。 dPCR は、初めて、 CDH1a遺伝子転写腸 GC と正常組織でのプレゼンスの評価に使用されました。
遺伝子の発現を決定する金本位法は、リアルタイム定量 PCR (qPCR) です。ただし、結果のデータは、変数をすることができます時々、質の悪い、特に、サンプルでターゲットのレベルが低い。この変動は、ポリメラーゼ活性およびプライマーアニー リングを阻害する非特異的増幅と競争力のある側の反応6につながる、汚染物質によって引き起こされることができます。
DPCR の基本的な生化学的原則が qPCR のそれらに類似している dPCR がゲノム DNA (gDNA) の非常に精密な測定を可能にするいくつかの利点を示しています/相補的 dna (cDNA)。確かに、dPCR は、それぞれはよくゼロまたは単一のターゲット分子を含む何千もの井戸にサンプルの校正分割に依存するエンドポイント反応です。増幅はターゲットのコピーを含んでいる井戸でのみ発生し、蛍光信号によって示されます。元のサンプルのターゲット分子の絶対数は、二項分布のポアソン統計7を使用して合計パーティションに正の比を決定することによって計算できます。
また、dPCR 技術標準曲線を実行する必要があると、それゆえ、関連付けられたバイアスと変動、ターゲット8,9; の直接定量を可能にします。汚染物質とその耐力阻害剤10; による効率とは関係なくより正確で再現性のある結果を出すそれより敏感な qPCR より特定と珍しいターゲットを検出するための信頼性の高い方法は。最後に、背景の分子が付いている競争を減らす複数の反応に、試料の分割と増幅を可能と gDNA/cDNA6 の単一の分子の検出を促進するターゲット検出限界を向上させる.検出とチップを使った dPCR による核酸の定量化はますますコピー数多型に適用されている、DNA の定量化の断片、および突然変異分析11,12,13、与えられた、精度と低材料は入力メソッドの要件です。さらに、dPCR は最近両方マイクロ Rna 遺伝子と14成績証明書5,15の解析に統合されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">TRIazol Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycogen 20 mg/ml</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iScript cDNA Synthesis kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">CDH1a IDT custom designed assay</td>
			<td style="width:159px;">Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:339px;">F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG 
			(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG 
			(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ 
			[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermocycler (Labcycler)</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>011-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dual Flat Block Sample Module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4425757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4486414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">4485513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4482592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4489084</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

それは存在しないに対しいくつかの胃癌 (GC) セルの行で表されるに発見されましたCDH1a、 CDH1遺伝子の非正規コピー正常な胃粘膜に。最近では、GC 患者から得られた新鮮凍結腫瘍組織のCDH1a転写バリアントを検出しました。デジタル PCR (dPCR) のチップを使ったアプローチがここに提示してこの変形組織サンプルでの発現を調べた。dPCR は核酸の正確、堅牢で、高感度測定の可能性を提供しています、さまざまな分野で多くのアプリケーションの活用がますます。dPCR は珍しいターゲットを検出さらに、dPCR は、校正器、標準曲線を必要とせず核酸の絶対かつ正確な定量化のための可能性を提供しています。実際には、パーティション分割反応阻害剤耐性と増幅効率を向上させる背景からターゲットを富ませます。このような特徴は、dPCR CDH1aまれなトラン スクリプトの検出のための最適なツールを作る。

ここに示す手順を使用して、我々 は胃新鮮凍結組織でまれな転写バリアントCDH1aの式のチェック。DPCR による解析を行った 21 ペア正常と癌組織サンプルその 11 追加腫瘍サンプル。CDH1aは、正常組織サンプルは、このまれなトラン スクリプト5の存在を示さなかったに対し 15 のうち 32 (47%) の腫瘍の検出でした。非均一荷重チップはあたか...

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Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR 法について説明します。

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

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The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

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チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出