Name: detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00
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Os autores desejam agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana do IRST.
Nota: Este procedimento é projetado especificamente para a detecção de um reduzido número de moléculas de cDNA em tecidos humanos fresco congelado. As secções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congelado, previamente validado tumor gástrico paciente-derivado ou amostras de tecido normal.
1. purificação e isolamento de RNA
<ol><li>
Extração de RNA...

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

dPCR foi originalmente desenvolvido para DNA molecular medições10,11,12,13 e no tempo que essa tecnologia foi adaptada para a quantificação de microRNAs e RNA transcritos5, 14,15. Neste protocolo, ampliamos a lista de aplicativos que incluem detecção de transcrições raras derivada de amostras ...

O gene CDH1 codifica para E-caderina, um factor-chave envolvidos na manutenção do epitélio gástrico normal através da regulamentação de1, de adesão, sobrevivência, proliferação e migração celular. Perda de proteína E-caderina, como resultado do germline deletério ou alterações somáticas de CDH1 tem sido associadas com o desenvolvimento de GC2,3. Non-canônico transcrições decorrentes intrão 2 do gene também tem sido a hipótese para desempenhar um papel na carcinogênese gástrica4,5. Em particular, uma tal transcrição, CDH1a, foi mostrada para ser expressa em células no GC, mas está ausente do estômago normal4. Recentemente detectamos CDH1a em amostras de tecido do GC de pacientes do GC usando chip baseada dPCR5. dPCR foi utilizado para avaliar, pela primeira vez, a presença da transcrição do gene CDH1a em GC intestinal e no tecido normal.
O método padrão-ouro para determinar a expressão do gene é PCR quantitativo em tempo real (qPCR). No entanto, os dados resultantes podem às vezes ser variável e de má qualidade, especialmente quando o nível do alvo na amostra é baixo. Esta variabilidade pode ser causada por contaminantes, que inibem a atividade do polymerase e recozimento da primeira demão, levando a amplificação não-específica e o lado competitivo reações6.
Embora os princípios básicos de bioquímicos da dPCR são semelhantes da qPCR, dPCR mostra algumas vantagens, permitindo medidas muito precisas do DNA genômico (gDNA) / complementar as moléculas de DNA (cDNA). Com efeito, dPCR é uma reação de ponto de extremidade que depende o particionamento calibrado de uma amostra em milhares de poços, para que cada um contém bem zero ou uma molécula alvo único. Então, amplificação ocorre apenas em poços que contém uma cópia do alvo e é indicada por um sinal fluorescente. O número absoluto de moléculas-alvo na amostra original, então, pode ser calculado determinando a proporção de positivos para totais partições usando binomial Poisson estatísticas7.
Além disso, a técnica de dPCR elimina a necessidade para a execução de uma curva padrão e, portanto, o viés associado e variabilidade, permitindo uma quantificação directa de alvos8,9; produz resultados mais precisos e reprodutíveis independentemente de contaminantes e eficiência devido a sua alta tolerância a inibidores de10; é mais sensível e específico que qPCR e, portanto, é um método confiável para a detecção de um destino de rara. Finalmente, o particionamento da amostra em várias reações reduz a competição com moléculas de fundo e melhora o limite de detecção de alvo, possibilitando a amplificação e facilitar a detecção de moléculas simples de gDNA/cDNA6 . A detecção e quantificação de ácidos nucleicos por chip baseada dPCR foi cada vez mais aplicado para copiar número variação, fragmentos de quantificação de DNA e mutação analisa11,12,13, dada a precisão e material de baixa exigência do método de entrada. Além disso, dPCR recentemente foi integrada a análise de ambos os microRNAs14 e gene transcrições5,15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">TRIazol Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycogen 20 mg/ml</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iScript cDNA Synthesis kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">CDH1a IDT custom designed assay</td>
			<td style="width:159px;">Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:339px;">F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG 
			(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG 
			(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ 
			[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermocycler (Labcycler)</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>011-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dual Flat Block Sample Module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4425757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4486414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">4485513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4482592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4489084</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

CDH1a, uma transcrição não-canônicos do gene CDH1 , foi encontrado para ser expressa em algumas linhas de células de câncer gástrico (GC), Considerando que está ausente na mucosa gástrica normal. Recentemente, nós detectamos variante de transcrição CDH1a em tecidos de tumor fresco congelado obtidos de pacientes com GC. A expressão desta variante em amostras de tecido foram investigada pela microplaqueta digital PCR (dPCR) abordagem aqui apresentada. dPCR oferece o potencial para uma medição precisa, robusta e altamente sensível de ácidos nucleicos e é cada vez mais utilizada para muitas aplicações em diferentes campos. dPCR é capaz de detectar alvos raros; Além disso, dPCR oferece a possibilidade de quantificação absoluta e precisa de ácidos nucleicos, sem a necessidade de calibradores e curvas padrão. Na verdade, o particionamento de reação enriquece o alvo do plano de fundo, o que melhora a eficiência de amplificação e tolerância aos inibidores. Tais características fazem dPCR uma ferramenta ideal para a deteção da transcrição CDH1a rara.

Usando o procedimento aqui apresentado, verificamos para a expressão da variante rara de transcrição CDH1a em tecidos gástricos fresco congelado. A análise por dPCR foi realizada em amostras de tecido normal e câncer 21-emparelhado e em 11 amostras de tumor adicionais. CDH1a foi detectável em tumores 15 de 32 (47%), Considerando que não há amostras de tecido normal mostraram a presença desta transcrição rara5. Em nossa análise, chips ...

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Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

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Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Pesquisa do câncer

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The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

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