Name: detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR at JoVE.com

Författarna vill tacka Gráinne Tierney för redaktionellt stöd.

Protokollet följer riktlinjerna i örsta mänsklig forskning etikkommittén.
Obs: Detta förfarande är särskilt utformad för detektion av ett lågt antal cDNA molekyler i färskfryst vävnader. Avsnitten vävnad har skurits på torris, medan fortfarande frysta, från tidigare validerade patientderiverade magsäcken tumör eller normala vävnadsprover.
1. RNA isolering och rening
<ol><li>
RNA-extraktion Obs: RNA isolering utförs under huven...

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li><li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Assays+Part+I:+Partitioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics.">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li><li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR:+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia.">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li><li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR.">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

dPCR utvecklades ursprungligen för DNA molekylär mätningar10,11,12,13 och i tid denna teknik var anpassad för kvantifiering av mikroRNA och RNA avskrifter5, 14,15. I detta protokoll har vi utvidgat listan över ansökningar om att inbegripa påvisande av sällsynta avskrifter härrör från färsk...

CDH1 genen kodar för E-cadherin, en nyckelfaktor som arbetar med underhåll av normal gastric epitel genom reglering av cell adhesion, överlevnad, spridning och migration1. Förlust av E-cadherin protein till följd av skadliga könsceller eller somatiska förändringar av CDH1 har associerats med utvecklingen av GC2,3. Icke-kanoniska avskrifter som härrör från intron 2 av genen har också antagit hypotesen för att spela en roll i gastric carcinogenes4,5. Särskilt en sådan avskrift, CDH1a, har visat att uttryckas i GC cellinjer men är frånvarande från den normala mage4. Vi har nyligen upptäckt CDH1a i GC vävnadsprover från GC patienter använder chip-baserade dPCR5. dPCR användes för att utvärdera, för första gången, förekomsten av CDH1a gen avskriften i intestinal GC och i normal vävnad.
Guld standard metod för att bestämma genuttryck är realtid kvantitativ PCR (qPCR). Men den resulterande data kan ibland vara variabel och av dålig kvalitet, speciellt när nivån på målet i provet är låg. Denna variation kan orsakas av föroreningar, som hämmar polymeras aktivitet och primer glödgning, leder till icke-specifik amplifiering och konkurrenskraftiga sida reaktioner6.
Även om biokemiska grundprinciperna för dPCR är liknande till de av qPCR, dPCR visar några fördelar, vilket möjliggör mycket exakta mätningar av genomisk DNA (gDNA) / kompletterande DNA (cDNA) molekyler. DPCR är faktiskt en slutpunkt reaktion som förlitar sig på en kalibrerad delning av ett prov till tusentals brunnar, så att varje väl innehåller noll eller en enda målmolekylen. Förstärkning sedan uppstår endast i brunnarna som innehåller en kopia av målet och indikeras av en fluorescerande signal. Det absoluta antalet målmolekyler i det ursprungliga provet kan sedan beräknas genom att bestämma förhållandet mellan positiva till totala partitioner använder binomiala Poisson statistik7.
Dessutom dPCR tekniken eliminerar behovet av kör en standardkurva och därmed den associerade bias och variabilitet, möjliggör en direkt kvantifiering av mål8,9. Det ger mer exakta och reproducerbara resultat oberoende av föroreningar och effektivitet på grund av dess höga tolerans-hämmare10. Det är mer känslig och specifik än qPCR, och är således en pålitlig metod för detektion av ett sällsynt mål. Slutligen av uppdelning av provet i flera reaktioner minskar konkurrensen med bakgrunden molekyler och förbättrar mål detektionsgränsen, möjliggöra förstärkning och underlätta upptäckt av enstaka molekyler av gDNA/cDNA6 . Detektering och kvantifiering av nukleinsyror av chip-baserade dPCR har tillämpats alltmer för att kopiera numret variation, kvantifiering av DNA fragment och mutation analyserar11,12,13, givet den precision och låg material ingång kravet på metoden. DPCR har dessutom nyligen integrerats i analysen av båda mikroRNA14 och gen avskrifter5,15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">TRIazol Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycogen 20 mg/ml</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">iScript cDNA Synthesis kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">CDH1a IDT custom designed assay</td>
			<td style="width:159px;">Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:339px;">F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG 
			(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG 
			(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ 
			[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermocycler (Labcycler)</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>011-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dual Flat Block Sample Module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4425757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4486414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">4485513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4482592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4489084</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

CDH1a, en icke-kanoniska avskrift av genen CDH1 , har konstaterats för att uttryckas i vissa ventrikelcancer (GC) cellinjer, det är frånvarande i normala magslemhinnan. Nyligen har upptäckt vi CDH1a avskrift variant i färskfryst tumörvävnad från patienter med GC. Ett uttryck för denna variant i vävnadsprover undersöktes av chip-baserade digitala PCR (dPCR) metoden presenteras här. dPCR erbjuder möjlighet till en noggrann, robust och mycket känsliga mätning av nukleinsyror och utnyttjas alltmer för många tillämpningar inom olika områden. dPCR är i stånd att upptäcka sällsynta mål; dPCR erbjuder dessutom möjligheten för absolut och exakt kvantifiering av nucleic syror utan behov av kalibratorer och standard kurvor. I själva verket berikar reaktion partitioneringen målet från bakgrunden, vilket förbättrar förstärkning effektivitet och tolerans-hämmare. Sådana egenskaper gör dPCR ett optimalt verktyg för detektion av CDH1a sällsynta avskriften.

Använda proceduren presenteras här, kontrolleras vi av uttryck för den sällsynta avskrift varianten CDH1a i magsäcken färskfryst vävnader. Analysen av dPCR utfördes på 21-parat normal och cancer vävnadsprover och i 11 ytterligare tumörprover. CDH1a var detekterbart i 15 av 32 (47%) tumörer, medan ingen normal vävnadsprover visade förekomst av denna sällsynta avskrift5. I vår analys avslogs marker med mindre än 13 000 datapunkter, ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR at JoVE.com

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Upptäckt av en CDH1 sällsynta avskrift Variant i färskfryst magsäckscancer vävnader av Chip-baserade digitala PCR

Manuskriptet beskriver en chip-baserade digitala PCR-test för att upptäcka en sällsynt CDH1 avskrift variant (CDH1a) i färskfryst normal och tumörvävnad från patienter med magsäckscancer.

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Utveckling av en mänsklig preklinisk modell av Osteoclastogenesis från perifert blod monocyter Co odlade med Breast Cancer cellinjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Detektion av sällsynta mutationer i CtDNA med nästa generations sekvensering

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum och Plasma kopia nummer detektering med realtids-PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk färgning på paraffin-inbäddade diabilder av pT3N0M0 mag cancer vävnad

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analys av immunofärgning av ZW10 interagerande protein i mänskliga lung vävnader

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Utvärdering av kolorektal cancer risk och prevalens av avföring DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Detektering av Retrotransponering aktivitet av hot LINE-1s med långdistans omvänd PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Upptäckt av lungtumörprogression hos möss av ultraljudsavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...