Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00
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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente in parte dalla Fondazione Novartis per medical - ricerca biologica (a PYM), il Gottfried e Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW e PYM) e la piscina di ricerca dell'Università di Friburgo (a PYM). Ulteriori contributi comprendono le borse di eccellenza della Confederazione Svizzera per studiosi stranieri (di KAB e SM). Ringraziamo Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess per supporto tecnico.

Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).
Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. 11 perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.
1. fluores...

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	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti6. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione d...

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età1. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti2. Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste piccole vescicole durante la malaria infezione3. È possibile che essi svolgono due ruoli importanti: da un lato, essi potrebbero contribuire alla patogenesi attivando i macrofagi4,5; e d'altra parte, essi potrebbero mediare la comunicazione cellulare tra parassiti e tra parassiti e host6,7. Infatti, i parassiti possono trasferire proteine o acidi nucleici tra loro tramite EVs. Ad esempio, Trypanosoma brucei rhodesiense SVE può trasferire fattore di virulenza Serum Resistance-Associated (SRA) e puoi indirizzare altri T. brucei e l'host eritrociti8. Inoltre, p. falciparum- iRBCs comunicano tra loro mediante il trasferimento di acidi nucleici all'interno di server virtuale di Exchange. In questo modo i parassiti ottimizzare e sincronizzare la sua crescita. Infatti, EVs potrebbe essere il principale regolatore di conversione gametocyte e quindi contribuire alla regolazione della trasmissione fase7.
Non solo SVE regolano i parassiti, anche mediano interazioni parassita-ospite. Abbiamo recentemente scoperto che SVE da iRBCs contengono derivati host microRNAs (miRNAs; piccole specie di RNA nella gamma di 21-25 nucleotidi9) che sono presi dalle cellule endoteliali umane. I miRNA nel server EVs formano un complesso con Ago2 stabile (un membro del RNA-induced silencing complex), che una volta consegnato il destinatario delle cellule, è in grado di specificamente silenziare l'espressione genica e che influenzano le proprietà barriera delle cellule10. Protocolli standard sono stati sviluppati per studiare la funzione del SVE. Qui, descriviamo in primo luogo un protocollo che consente l'etichettatura fluorescente di EVs per indagare il loro assorbimento dalle cellule recettive. Inoltre, utilizzando un microscopio confocale, è possibile tenere traccia di destino di EV all'interno della cellula. Diversi coloranti fluorescenti utilizzabile per tenere traccia di EVs. L'ammina-reattivo colorante, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) e fluorescenti di calceina-AM diventa una volta all'interno delle vescicole. Preferiamo utilizzare l'etichetta anfifiliche, PKH, perché dà un segnale più luminoso e uniforme. Questo approccio fornisce informazioni importanti per comprendere le interazioni tra EVs e cellule recettive. Mentre in alcuni casi EVs legarsi alla superficie delle cellule, alcune vescicole sono prese velocemente. Dopo l'assorbimento, EVs consegnare loro carichi per le cellule, in cui esercitano le loro funzioni di regolamentazione.
Qui, descriviamo un protocollo per misurare la funzione della barriera di cellule endoteliali in vitro quantificando il trasferimento di un destrano fluorescente attraverso un monostrato cellulare. Più sensibili traccianti possono essere utilizzati come marcatori radioattivi. Tuttavia, richiedono speciali precauzioni per l'uso. Altri saggi esistono per misurare la funzione di barriera in vitro come resistenza elettrica transendoteliale (TEER), che misura l'integrità stretta della giunzione. Infine visualizzare ZO-1, una proteina di giunzione stretta, dall'immunofluorescenza consente la valutazione dell'integrità di giunzione stretta come ben10. Poiché SVE sono entità complesse ed eterogenee, contenente diversi carichi con potenziale normativo caratteristica, è utile iperesprimono un RNA specifico per studiare il suo effetto sulla cellula ricevente. Di conseguenza, si definisce anche un protocollo che mira a generare linee cellulari stabili che esprimono il miRNA di interesse10.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.

Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo ...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

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