Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00
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이 연구 재정적으로 일부 의학-생물학 연구 (미국적)를,는 고트프리트 줄리아 Bangerter-Rhyner-재단 (MW 미국적)를, 그리고 Fribourg의 대학 (에 미국적)의 연구 수영장에 대 한 노바 티 스 재단에 의해 지원 되었다. 추가 보조금 외국 학자 (갑과 SM) 스위스 정부 우수 장학금 포함 됩니다. 우리 기술 지원에 대 한 이자벨 Fellay와 Solange Kharoubi 헤스 감사합니다.

인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.
참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. 11 P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.
1. 형광 EVs의 라벨
<p clas...

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas 등 여러 기생충 감염 된 주인 세포에 의해 EVs의 석방을 트리거합니다. 병원 체에 따라 출시 된 EVs 호스트 면역 반응을 조절 하거나 기생충6사이 셀룰러 통신을 중재 수 있습니다. 그러나, 이러한 작은 소포 말라리아 질병에 기여 하는 방법을 제안 하는 조금 기록이 있다. 여기, 우리는 변형 체 감염 동안 EVs의 기능을 조사 하기 위해 여러 ...

세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이1의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의2. 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염3동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma brucei rhodesiense EVs 독성 요소 Serum Resistance-Associated (SRA)를 전송할 수 있습니다 그리고 다른 T. brucei 와 호스트 모두 적혈구8타겟팅 할 수 있습니다. 또한, P. falciparumiRBCs EVs 내의 핵 산을 전송 하 여 서로 간에 통신 합니다. 기생충을 최적화 하 고의 성장을 동기화 수 있습니다. 사실, EVs gametocyte 변환의 주요 레 귤 레이 터 수 되 고 따라서 전송 단계7의 규정에 기여.
뿐만 아니라 EVs는 기생충을 통제, 그들은 또한 기생충-호스트 상호 작용을 중재. 우리는 최근에 iRBCs에서 EVs 호스트 파생 microRNAs (miRNAs; 21-25의 뉴클레오티드9의 범위에 작은 RNA 종) 인간의 내 피 세포에 의해 채택 되었다을 포함 발견 했다. EVs에 miRNAs 안정 Ago2와 복잡 한 형성 (구성원 RNA 유도 침묵의 복잡 한), 받는 사람 세포에 전달 되 면 구체적으로 유전자 발현을 침묵 하 고 셀10의 장벽 속성에 영향을 미치는입니다. 표준 프로토콜 EVs의 기능을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 자, 먼저 받는 사람 세포에 의해 그들의 통풍 관을 조사 하기 위해 EVs의 형광 라벨 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, confocal 현미경을 사용 하 여 셀 내부 EV의 운명을 추적 수는. 여러 형광 염료 EVs를 추적을 사용할 수 있습니다. 아민-반응성 염료, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 그리고는 소포 안에 한 번 Calcein-오전 될 형광. 밝게 하 고 더 많은 일정 한 신호를 제공 하기 때문에 우리 PKH, amphiphilic 레이블을 사용을 선호 합니다. 이 방법은 EVs와 받는 사람 세포 간의 상호 작용을 이해 하는 중요 한 정보를 제공 합니다. 경우에 따라 EVs는 세포의 표면에 묶는, 하는 동안 일부 소포는 급속 하 게 채택 되었다. 글귀, 시 EVs는 그들은 그들의 규정 하는 기능을 발휘 하는 세포에 그들의 화물을 제공 합니다.
여기, 우리는 세포 단층을 통해 형광 dextran의 전송을 측정 하 여 체 외에서 내 피 세포의 장벽 기능을 측정 하는 프로토콜을 설명 합니다. 방사선된 마커 같은 더 민감한 추적기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 사용 하기 위해 특별 한 안전 조치를 요구 한다. 다른 분석 실험 꽉 접합 무결성 측정 transendothelial 전기 저항 (TEER) 같은 생체 외에서 의 장벽 기능을 측정 하기 위해 존재 한다. 마지막으로 조로-1, 긴밀 접합 단백질 면역 형광에 의해 시각화 뿐만 아니라10으로 꽉 접합 무결성 평가 수 있습니다. EVs 잠재적인 규정 특성을 가진 여러 화물을 포함 하는 복잡 하 고 유형이 다른 엔터티 있기 때문에, 그것을 받는 사람 세포에 미치는 영향을 연구 하는 특정 RNA overexpress 유용 합니다. 따라서, 우리는 또한 관심10의 miRNA를 표현 안정적 셀 라인을 생성 하는 것을 목표로 하는 프로토콜을 정의 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

말라리아는 변형 체 기생충으로 인 한 생명이 질병, P. falciparum 되 가장 아프리카 대륙에서 우세 하 고 대부분 말라리아 관련 사망자에 대 한 책임 세계적으로. 조직, 혈관 부전, 및 염증 응답 기생충 격리 등 여러 가지 요인 말라리아에 감염 된 사람들에 있는 질병의 진화에 영향. P. falciparum-감염 된 적혈구 (iRBCs) 출시 작은 extracellular 소포 (EVs) 기생충과 호스트 사이의 pathogenesis 및 휴대 통신을 중재 하는 화물 분자의 다른 종류를 포함. EVs는 효율적으로 있는 그들은 그들의 기능을 조절 하는 세포에 의해 촬영. 여기 우리는 기생충-호스트 상호 작용에서 EVs의 역할을 해결 하기 위해 전략을 논의. 첫째, 우리는 녹색 셀 링커 염료를 사용 하 여 레이블 및 내 피 세포에 의해 EV 국제화를 추적 간단 방법을 설명 합니다. 둘째, 우리 보고 붙일 레이블된 dextran을 사용 하 여 내 피 세포 단층에서 침투성을 측정 하는 간단한 방법. 마지막으로, 우리 내 피 세포 기능에 작은 비 코딩 RNA 분자의 역할을 조사 하는 방법을 보여 줍니다.

여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

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Research

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