Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Financeiramente, este estudo foi suportado em parte pela Fundação Novartis medical - pesquisa biológica (para PYM), o Gottfried e Julia Bangerter-Naraa-Stiftung (para MW e PYM) e a piscina de pesquisa da Universidade de Friburgo (para PYM). Subsídios adicionais incluem as bolsas de excelência de governo suíço para estrangeiros os estudiosos (KAB e SM). Agradecemos a Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess para suporte técnico.

Hemácias humanas foram obtidas a partir do sangue de doadores saudáveis, em conformidade com as diretrizes da Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parasita por p. falciparum (3 7) EV produção foram anteriormente descritas em Mbagwu, et al. 11 porque por p. falciparum é um patógeno humano, consulte os regulamentos locais para manipulação. As culturas devem ser mantidas estéril todo o tempo.
1. a flu...

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port:+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake.">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Diversos parasitas, incluindo Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas desencadear a liberação de EVs pela célula hospedeira infectada. Dependendo dos patógenos, os EVs lançados podem modular a resposta imune do hospedeiro ou mediar a comunicação celular entre os parasitas6. No entanto, há poucas evidências sugerindo como essas pequenas vesículas contribuam para a doença da malária. Aqui, descrevemos várias maneiras de investigar a função do EVs durante a infecção de ...

De acordo com a Organização Mundial de saúde, havia 212 milhões de novos casos de malária em todo o mundo em 2015 e aproximadamente 429.000 pessoas morreram, principalmente de crianças menores de cinco anos de idade1. Os mecanismos, levando a doença grave, que é frequentemente associada com disfunção vascular, permanecem mal-definidas2. Plasmodium- iRBCs secretam esferas pequenas membrana bi-lipídica conhecidas como vesículas extracelulares (EVs). Sabe-se que esses EVs são potencialmente relevantes para o processo de infecção e a resposta imune do hospedeiro à infecção; no entanto, pouco se sabe sobre a função exata destas pequenas vesículas durante a infecção de malária3. É possível que eles desempenham duas funções importantes: por um lado, eles possam contribuir para a patogênese ativando os macrófagos4,5; e, por outro lado, eles podem mediar a comunicação celular entre parasitas e entre parasitas e anfitrião6,7. Na verdade, parasitas podem transferir proteínas ou ácidos nucleicos entre si através de EVs. Por exemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs pode transferir factor de virulência Serum Resistance-Associated (SRA) e pode ter como alvo outros T. brucei e o host de eritrócitos8. Além disso, por p. falciparum- iRBCs se comunicar entre si através da transferência de ácidos nucleicos dentro EVs. Isso permite que os parasitas otimizar e sincronizar o seu crescimento. Na verdade, EVs podem ser o grande regulador da conversão de Gametócito e, portanto, contribuir para o Regulamento da transmissão etapa7.
Não só fazem EVs regulam os parasitas, eles também mediam interações parasita-hospedeiro. Recentemente, descobri que EVs de iRBCs contenham derivados de anfitrião microRNAs (miRNAs; pequenas espécies de RNA no intervalo de 21-25 nucleotides9) que foram retomadas por células endoteliais humanas. Os miRNAs em EVs formam complexos com Ago2 um estábulo (membro o silenciamento de RNA-induced complex), que uma vez entregue para as células de destinatário, é capaz de especificamente silenciar a expressão de gene e que afetam as propriedades de barreira dos10células. Protocolos padrão foram desenvolvidos para investigar a função do EVs. Aqui, primeiro descrevemos um protocolo que permite que a rotulagem fluorescente do EVs para investigar sua absorção pelas células do destinatários. Além disso, usando um microscópio confocal, é possível rastrear o destino o EV no interior da célula. Vários corantes fluorescentes podem ser usados para rastrear EVs. O corante reativo-amina, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e fluorescentes de calceína-AM se tornar uma vez dentro de vesículas. Nós preferimos usar o rótulo anfifílica, PKH, porque dá um sinal mais brilhante e mais uniforme. Essa abordagem fornece informações importantes para compreender as interações entre células destinatários e EVs. Enquanto em alguns casos EVs se ligam à superfície das células, algumas vesículas rapidamente são retomadas. Após absorção, EVs entregam suas cargas para as células, em que exercem suas funções reguladoras.
Aqui, descrevemos um protocolo para medir a função de barreira de células endoteliais em vitro quantificando a transferência de uma fluorescente dextran através de uma monocamada celular. Marcadores mais sensíveis podem ser usados como marcadores radiolabeled. No entanto, eles exigem precauções especiais de segurança para uso. Outros ensaios existem para medir a função de barreira em vitro como resistência elétrica transendothelial (TEER), que mede a integridade da junção apertada. Finalmente, Visualizar ZO-1, uma proteína da junção apertada, por imunofluorescência permite a avaliação da integridade da junção apertada como bem10. Desde EVs são entidades complexas e heterogêneas, contendo várias cargas com característica potencial de regulamentação, é útil para overexpress um RNA específico para estudar seu efeito sobre a célula de destinatário. Portanto, nós também definir um protocolo que visa gerar linhas de células estáveis expressando a miRNA de juros10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

A malária é uma doença fatal causada por parasitas Plasmodium , por p. falciparum sendo a mais prevalente no continente africano e responsável pela maioria das mortes relacionadas com a malária globalmente. Vários fatores, incluindo a fixação do parasita em tecidos, disfunção vascular e respostas inflamatórias influenciam a evolução da doença em pessoas infectadas por malária. Por p. falciparum-glóbulos vermelhos infectados (iRBCs) liberar pequenas vesículas extracelulares (EVs) contendo diferentes tipos de moléculas de carga que medeiam a comunicação celular e patogênese entre parasita e hospedeiro. SVE eficientemente é ocupados por células na qual eles modulam sua função. Aqui vamos discutir estratégias para abordar o papel do EVs em interações parasita-hospedeiro. Primeiro, nós descrevemos um método simples para a rotulagem e rastreamento EV internalização pelas células endoteliais, usando um corante de vinculador de célula verde. Em segundo lugar, nós relatamos uma maneira simples de medir a permeabilidade através de uma monocamada de células endoteliais usando um fluorescente etiquetado dextrano. Finalmente, mostramos como investigar o papel de pequenas moléculas de RNA não-codificante em função da célula endotelial.

Aqui, descrevemos os protocolos para investigar as interações de EVs com células hospedeiras. A absorção de fluorescente etiquetadas EVs é monitorada pela microscopia confocal (Figura 1). Células endoteliais eficientemente pegam EVs, porém o tempo de incubação com EVs pode ser otimizado para controlar a absorção. Para uma melhor localização de EVs no interior das células, mancha actina com faloidina. Em seguida, usamos um filtro de membrana no ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Imunologia e Infecção

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Pintura de cromossomo 2D e 3D em mosquitos da malária

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

Avaliação do lactato sanguíneo e Plasma insulina durante o exercício de alta intensidade por cateterização da veia Antecubital

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Medição de temperatura de corpo do mouse usando o termômetro infravermelho durante passiva anafilaxia sistêmica e avaliação de alergia alimentar

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...