Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00
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Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Novartis para el médico y biológico investigación (PYM), el Gottfried y Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW y PYM) y el grupo de investigación de la Universidad de Friburgo (a PYM). Subvenciones adicionales incluyen las becas de excelencia de gobierno suizo para académicos extranjeros (a KAB y SM). Agradecemos a Isabelle Fellay y Solange Kharoubi Hess para el soporte técnico.

Glóbulos rojos humanos fueron obtenidos de la sangre de donantes sanos, siguiendo las directrices de Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parásito p. falciparum (3 7) y la producción de EV fueron descritos previamente en Mbagwu, et al. 11 debido a p. falciparum es un patógeno humano, consulte las normas locales para el manejo. Las culturas deben conservarse estéril todo el tiempo.
1. fluorescencia de e...

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	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Varias parásitos, incluyendo el Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania y Trichomonas desencadenan la liberación de los vehículos eléctricos por la célula huésped infectada. Dependiendo de los patógenos, el EVs liberado puede modular la respuesta inmune del huésped o median la comunicación celular entre los parásitos6. Sin embargo, hay poca evidencia que sugiere cómo estas vesículas pequeñas contribuyen a la enfermedad de la malaria. Aquí, hemos descrito varias maneras de investigar la f...

Según la Organización Mundial de la salud, había 212 millones de nuevos casos de malaria en todo el mundo en 2015 y aproximadamente 429.000 personas murieron, principalmente a niños menores de cinco años de edad1. Los mecanismos que conducen a la enfermedad severa, que a menudo se asocia con disfunción vascular, siendo mal definidas2. Plasmodium- iRBCs secretan esferas pequeñas de bi-lípidos de membrana conocidas como vesículas extracelulares (EVs). Es sabido que los EVs son potencialmente relevantes para el proceso de infección y la respuesta inmune del huésped a la infección; sin embargo, poco se sabe sobre la función exacta de estas vesículas pequeñas durante la infección de la malaria3. Es posible que juegan dos papeles importantes: por un lado, podría contribuir a la patogenesia activando macrófagos4,5; y por otro lado, podría mediar comunicación celular entre parásitos y entre parásitos y huésped6,7. De hecho, parásitos pueden transferir proteínas o ácidos nucleicos entre sí a través de EVs. Por ejemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs puede transferir factor de virulencia Serum Resistance-Associated (SRA) y puede dirigirse a otros T. brucei y host eritrocitos8. Además, por p. falciparum- iRBCs comunicarse entre sí mediante la transferencia de ácidos nucleicos dentro de EVs. Esto permite que los parásitos optimizar y sincronizar su crecimiento. De hecho, EVs podría ser el regulador principal de conversión gametocyte y por lo tanto contribuir a la regulación de la fase de transmisión7.
No sólo lo EVs regulan los parásitos, también median las interacciones huésped parásito. Recientemente hemos descubierto que los EVs de iRBCs contienen microRNAs derivados del host (miRNAs; especies pequeñas de RNA en el rango de 21-25 nucleótidos9) que son tomados por células endoteliales humanas. Los miRNAs en el EVs forman un complejo con antes2 estable (un miembro de la RNA-inducido silenciando complejo), que una vez entregado a las células del receptoras, es capaz de silenciar genes específicamente y que afectan a las propiedades de barrera de las células10. Protocolos se han desarrollado para investigar la función de los vehículos eléctricos. Aquí, describimos primero un protocolo que permite el etiquetado fluorescente de EVs para investigar su absorción por las células del receptoras. Además, mediante el uso de un microscopio confocal, es posible rastrear el destino de la EV interior de la célula. Varios tintes fluorescentes pueden utilizarse para rastrear la EVs. El tinte reactivo amino, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato Succinimidyl (CFSE) y fluorescente de calceína-AM se convierten una vez dentro de las vesículas. Preferimos utilizar la etiqueta anfifílicas, PKH, porque da una señal más brillante y más uniforme. Este enfoque proporciona información importante para entender las interacciones entre células receptores y EVs. Mientras que en algunos casos EVs se unen a la superficie de las células, algunas vesículas se toman rápidamente. A absorción, EVs entregar sus cargas a las células, en el cual ejercen sus funciones reguladoras.
Aquí, describimos un protocolo para medir la función de barrera de las células endoteliales en vitro mediante la cuantificación de la transferencia de un dextrano fluorescente a través de una monocapa celular. Marcadores más sensibles pueden utilizarse como marcadores radiactivos. Sin embargo, requieren precauciones especiales para el uso. Otros ensayos existen para medir la función de barrera en vitro como resistencia eléctrica transendothelial (TEER), que mide la integridad de la ensambladura apretada. Finalmente visualizar ZO-1, una proteína de Unión estrecha, por inmunofluorescencia permite la evaluación de la integridad de la ensambladura apretada bien10. Como EVs son entidades complejas y heterogéneas que contienen varias cargas con característica reguladora potencial, es útil para sobreexpresar un ARN específico para estudiar su efecto sobre la célula receptora. Por lo tanto, definimos también un protocolo que pretende generar líneas celulares estables expresando la miRNA de interés10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

La malaria es una enfermedad potencialmente mortal causada por parásitos de Plasmodium , p. falciparum siendo la más frecuente en el continente africano y responsable de la mayoría de las muertes relacionadas con el paludismo a nivel mundial. Varios factores, incluyendo el secuestro de parásito en los tejidos, disfunción vascular y las respuestas inflamatorias influyen en la evolución de la enfermedad en personas infectadas por la malaria. P. falciparum-glóbulos rojos infectados (iRBCs) liberar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) que contiene diferentes tipos de carga moléculas que median la comunicación celular y patogénesis entre parásitos y huésped. EVs se toman eficientemente por las células en las que modula su función. Aquí se discuten estrategias para abordar el papel de EVs en las interacciones huésped parásito. En primer lugar, se describe un método sencillo para el etiquetado y seguimiento EV internalización por las células endoteliales, usando un tinte de vinculador de celda verde. En segundo lugar, se presenta una forma sencilla de medir permeabilidad en una monocapa de células endoteliales mediante el uso de un fluorescente etiquetado dextrano. Por último, os mostramos cómo investigar el papel de pequeñas moléculas de ARN no codificante en función de la célula endotelial.

Aquí, describimos protocolos para investigar las interacciones de EVs con las células del huésped. La absorción de la fluorescencia etiquetadas EVs es supervisada por microscopía confocal (figura 1). Las células endoteliales toman eficientemente EVs, sin embargo el tiempo de incubación con EVs puede optimizarse para el seguimiento de la absorción. Para una mejor localización de los vehículos eléctricos dentro de las células, mancha de actina con p...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

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