Name: a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

ونشكر نحن المتعاونين، ستيفن جونز، تشارينجتون نيا، د. ديانا مار، والدكتور سامانثا كوبر من مركز علم الأحياء الرقمية (شركة بيو-راد CA) تصميمها المقايسة الدعم؛ نزار رغيي والدكتور عبدالله عبدالعزيز البقمي (نورجين بيوتك، كندا) للمشورة حاسمة عند تحسين استخراج الحمض النووي الريبي البروتوكول؛ وكامبل شانون وجيف فينستيرير، مارتيلو شانون وسكوت ثورستون انوش جولين للمساعدة في اختبار الاحتياجات ورصد التجارية.

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

G.A.P. وكيه، صاحب الجلالة وهذه هي موظفا من وامتلاك أسهم في شركة بيوديسيكس صاحب الجلالة وهذه G.A.P. هي المخترعين المشاركين على تطبيق براءات الاختراع المقدمة من بيوديسيكس، الذي يغطي نظام اختبار تشخيصي للكشف عن تعميم المتغيرات الجينية في الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة.

ترتيبات جديدة المقصود بالصندوق و ROS1 يشكلون معا ~ 3% الطفرات سائق داخل السكان NSCLC18. على الرغم من النادر، الكشف عن هذه التعديلات الوراثية أمر حيوي. مرضى NSCLC مع هذه التعديلات قد تستفيد من العلاجات المستهدفة التي تعوق النشاط كيناز الشاذة التي تنتج من البروتين أونكو13على وجه التحديد. بعض هذه العلاجات هي سبق أن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير للاستخدام في ROS1 NSCLC إيجابية، بينما البعض الآخر أظهرت أن تكون فعالة ضد المقصود بالصندوق في التجارب السريرية19.
بكر التكنولوجيا الرقمية توفر الحساسية التي مثالية ل التطبيقات خزعة سائلة20. هناك اعتماد كبير لهذه التكنولوجيا للاستخدام مع تعميم خالية من خلايا الحمض النووي لقياس الورم طفرات في مرضى NSCLC4،،من621،،من2223 . بالإضافة إلى كفدنا، قمنا بتطوير بروتوكول مصمم لقياس قوة المتغيرات الانصهار الأكثر انتشارا في مرضى NSCLC من تعميم الورم الحمض النووي الريبي (الشكل 1أ)10.
لدينا البروتوكول المعمول يسمح لحدود التحليلية للكشف وصولاً إلى 0.2% (الشكل 2). أن RT-دبكر استثنائية محددة وحساسة، فحوصات تقتصر على لوحة المتغيرات الانصهار المعروفة التي يتم اختيارها ومتعدد للكشف في التحليل PCR. وبالتالي، يجب تحديد الأنشطار التي ستدرج في فحوصات متعدد بعناية لضمان التغطية المناسبة للسكان من مرضى NSCLC. لقد قمنا بتصميم الاختبارات بنجاح للمقصود بالصندوق و ROS1 في نفس الوقت الكشف عن ثمانية الانصهار المتغيرات الناتجة عن ترتيبات جديدة للمكان المقصود بالصندوق أو ROS1 وتغطي 99% و 88% من السكان إيجابية المقصود بالصندوق و ROS1، على التوالي (الشكل 1ب-ج )17.
سير الاختبار النهائي كما هو موضح في هذه الدراسة يتضمن عناصر تحكم دفعة لضمان اتساق نتائج. وتشمل هذه الضوابط معيار تحليل إيجابية فضلا عن عنصري تحكم السلبية، التي تكفل معا لا يوجد تلوث أو تثبيط PCR التي تحدث داخل المجموعة (الشكل 3). ولضمان متانة المقايسة، أجرى دراسة استخدام الضوابط دفعة خلال فترة 21 يوما (الشكل 3د، ح). وتبين هذه البيانات اتساق عملية الجيش الملكي النيبالي المنصوص عليها في هذا البروتوكول.
الممارسات المختبرية الجيدة والتعامل مع الحمض النووي الريبي المناسبة من المكونات الرئيسية لضمان نتائج قوية ودقيقة. مختبر الفضاء ومعدات مخصصة للاستخدام مع الجيش الملكي النيبالي، تنظيف المعدات بعد كل استعمال واستخدام خالية رناسي الكواشف والمواد الاستهلاكية وتطبيق رذاذ المنظمة رناسي إلى مساحة العمل كل ما يساعد على الحد من تلويث رنسيس. معالجة الضميري من عينات الحمض النووي الريبي من الفنيين، بما في ذلك معطف مختبر مخصص، كثرة التغييرات القفازات، والعمل بسرعة من خلال إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي، وحفظ العينات في الثلج، ذات أهمية قصوى للحفاظ على سلامة العينة. الجيش الملكي النيبالي بمجرد عكس نسخها إلى كدنا، تكون العينة في شكل أكثر استقرارا يمكن أن يكون أقل عرضه للتدهور. بالإضافة إلى الممارسات التي تدعم سلامة الحمض النووي الريبي، ينبغي الاحتفاظ بعينات ومكونات PCR في مناطق معزولة لمنع التلوث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. الأسهم PCR الكواشف وإعداد يمزج PCR الرئيسي ينبغي أن تظل منفصلة من قوالب بكر وينبغي اتخاذ عناية كبيرة لفصل قالب تضخيم (وظيفة-PCR) من جميع مواد تضخيم مسبقاً بما في ذلك الكواشف، والجيش الملكي النيبالي، وكدنا عينات. وأخيراً، جيل سليم وتناول مستحلب يمزج PCR قبل التضخيم المركزية للحفاظ على سلامة الحبرية والظروف المثلى دبكر. والاحتياطات مثل هذه الحرجة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول للحصول على نتائج متسقة ودقيقة. ينبغي دراسة جميع البيانات موظفون مدربون قبل الإفراج عن النتائج أن تتأكد من الوفاء بجميع المقاييس ومراقبة الجودة. في حالة الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل (الشكل 4)، يجب مراجعتها بواسطة الموظفين التقنيين ومدير مختبر الدفعة وقد تتطلب إعادة المعالجة.
يمكن أن تنتج نتائج دبكر RT أقرب وقت 24 ساعة من استلام العينة و 95% من نتائج العينة داخل اختبار تعيين المستخدمة في هذه الدراسة (n = 984) أفيد أن يأمر الطبيب في أقل من 72 ساعة من وقت استلام (الشكل 5). يوفر هذا الوقت تحول الأطباء مع الكثير بحاجة إلى المعلومات الجزيئية في إطار الزمني الذي يتيح البدء بالعلاج المناسب. هذه النتائج متوفرة عادة في وقت سابق من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام خزعة نسيج تقليدية. إضافية المؤشرات الحيوية ل NSCLC وغيرها من أنواع السرطان يمكن تطويرها باستخدام النهج القائمة على الحمض النووي الريبي يتناقل مماثلة، وأن تستفيد نفس الوقت-إلى-نتائج سريعة. على سبيل المثال، يمكن قياس النص مرناً المبرمجة الموت [ليغند] 1 (PD-L1) استخدام الرايت دبكر إبلاغ الأطباء حول خيارات العلاج المناعي. وهناك أيضا اهتمام متزايد بفائدة خزعة سائلة ودبكر في الرصد للفعالية العلاجية. مؤشرات سابقة لعودة ظهور الورم باستخدام الجينوم اختبار لمتغيرات محددة يمكن أن يسمح الأطباء لضبط نظم العلاج قبل المرضى أعراض وفق المعايير المتعلقة بتدابير الرعاية مثل التصوير24. بروتوكولات مثل تلك التي ذكرت في هذه الدراسة مثالية للرصد بسبب غير اختزاع، والحساسية، والدوران السريع وقتهم، والفعالية من حيث التكلفة. يوفر الفحص الموضحة هنا النتائج في غضون 72 ساعة من استلام العينة، مع معدلات الحد الأدنى الكشف إيجابية كاذبة، مما يسهل اتخاذ قرارات العلاج السريع وتلتف بعض القيود التي واجهت مع الاختبار على أساس النسيج4.
لدينا بروتوكول وبيانات توضح نظام اختبار قوية لتحديد المتغيرات الحمض النووي الريبي وفرة منخفضة، فضلا عن إمكانيات الطفرة على أساس الدم الاختبار في الممارسة السريرية. للمرضى الذين لم يكن لديك برنامج تشغيل القابلة للتنفيذ الطفرات السريعة خزعة سائلة المستهدفة التي حددها النهج مثل هذا واحد، وإضافة أوسع المجين والبروتين اختبار من الأنسجة والدم قد توفر معلومات سريرية أوسع دعم تخطيط العلاج.

تصل إلى 25% من الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى قد لا يكون الأنسجة كافية متوفرة للاختبار في وقت التشخيص. حتى في الحالات التي تتوفر فيها الأنسجة، قد لا تكون كافية كمية أو نوعية أداء المستحسن الاختبارات الجزيئية1،2. وفي الحالات التي يوجد فيها ما يكفي من الأنسجة من خزعة للتنميط الجزيئي، المرضى قد تضطر إلى الانتظار عدة أسابيع أو أكثر للحصول على النتائج، أو البدء في العلاج بدون نتائج الجزيئية3،4. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون التشخيص الجزيئي الزاخر بالمعلومات المتاحة نظراً إلى ظهور عدة خيارات العلاج الموجهة للمرضى الذين شخصت NSCLC. اختبار المتداولة دون خلايا الحمض النووي (كفدنا) من خزعة سائلة إيجاد حل لتحديات الأنسجة التقليدية اختبار4،،من56. وتشمل خيارات الاختبار الحالية للتنفيذ الطفرات في NSCLC باستخدام كفدنا وسير عمل المستندة إلى دبكر مماثلة لتوليد نتائج سريعة، ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) توعية الطفرات ΔE746-A750 و L858R، EGFR الطفرات المقاومة T790M ، متغيرات كراس Proto-Oncogene (كراس)، والبديل بروتوونكوجيني ب-سلاح الجو الملكي البريطاني (براف) V600E. على الرغم من أن لا اعتمد على أوسع نطاق حسب الحقل، تعميم المستمدة من ورم رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) المعزولة من خزعة سائلة يمكن أن توفر أيضا المعلومات السريرية الهامة7،،من89. ونحن سابقا وضعت وأبلغ عن أساليب الكشف متعدد Microtubule Echinoderm البروتينات المرتبطة مثل 4-المتحولة لمفوما مستقبلات التيروزين كيناز (EML4-كيه) الانصهار المتغيرات من بلازما الدم10. في هذه الدراسة، فإننا بمد هذه الأساليب تشمل أعلى ترتيب متعدد الأهداف الجيش الملكي النيبالي ROS1 والمقصود بالصندوق، الذي يغطي ثمانية متغيرات الانصهار داخل كل مقايسة. وكان الهدف تطوير تقنية سريعة وحساسة ومحددة واستنساخه للكشف عن هذه المتغيرات الانصهار من البلازما للمرضى الذين شخصت سابقا NSCLC.
تبدأ عملية اختبار في مكتب الطبيب باستخدام الحمض النووي الريبي استقرار أنابيب جمع الدم11. تحتوي هذه الأنابيب على خلية الصائن كذلك مثبطات رناسي. عينات هي الأولوية التي يتم شحنها بين عشية وضحاها إلى مركزية المعتمدين في الكلية الأمريكية كاب الباثولوجيا اﻻكلينيكي تحسين مختبر التعديلات (العملية)-المختبرات المعتمدة (المختبرات الطبية) للمعالجة بموظفين أكفاء. وبمجرد تلقي "المختبرات السريرية"، تجري كل خطوة لتجهيز تحت "إجراءات التشغيل الموحدة" المعتمدة (SOP). يتم تثفيل الدم كله لاسترداد البلازما، ثم تستخدم لعزل الحمض النووي الريبي التي أما تعميم الحرة في الدم أو داخل تغليف مويتيس، مثل اكسوسوميس والصفائح الدموية7،،من89. لعزل الحمض النووي الريبي من هذه المقصورات، اخترنا نظام استرداد الجيش الملكي النيبالي استناداً إلى مقارنات بين عدة أساليب الاستخراج. الجيش الملكي النيبالي المعزول مركزة وعكس نسخها إلى كدنا. وقيمت عدة الإشعال الخاصة بالجينات والأنزيمات المنتسخة العكسية خلال الاستغلال الأمثل لأسلوب التوليف كدنا لتعظيم ROS1 والمقصود بالصندوق المستهدفة نسخة التحويل10. هذا أمر بالغ الأهمية لوفرة منخفضة تعميم النصوص، مثل المتغيرات المشتقة من ورم الانصهار. وأخيراً، نحن الأمثل دبكر تركيزات التمهيدي والتحقيق للسماح للكشف عن متعدد المتغيرات الانصهار المقصود بالصندوق أو ROS1 ومراقبة الجينات، جلوكورونيداسي-β (جوسب). نحن ثم ضم أفضل الظروف من كل الدراسات الأمثل إلى بروتوكول تخوض نهائي قبل إجراء دراسات تحليلية التحقق من الصحة المبينة في هذا التقرير. هذا البروتوكول وهذه النتائج أساسا لسير عمل السريع وحساسة للكشف عن المتغيرات الانصهار نادرة في الدورة الدموية الروتينية.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

قمنا بتطوير أساليب جديدة لعزل وتوصيف المستمدة من ورم يتناقل الريبي (كرنا) لخزعة سائلة على أساس الدم. كشف قوية من كرنا المستردة من الدم يمثل حلاً لحاجة غير ملباة حاسمة في التشخيص السريري. ويبدأ الاختبار بجمع الدم كله في أنابيب جمع الدم المحتوية على المواد الحافظة إلى استقرار كرنا. الخلية الحرة، اكسوسومال، والجيش الملكي النيبالي الصفائح الدموية المرتبطة يتم عزل من البلازما في اختبار هذا النظام. كرنا عكس نسخها للحمض النووي التكميلية (كدنا) وتضخيم استخدام الرقمية البلمرة المتسلسل (دبكر). يتم تقييم عينات للعلامات البيولوجية المستهدفة فضلا عن مورثة عنصر تحكم. اختبار التحقق من صحة إدراج الحد من الكشف، والدقة، ومتانة الدراسات مع نماذج تحليلية. الكشف عن الطريقة التي تم تطويرها نتيجة لهذه الدراسات تكاثر متعددة الانصهار المتغيرات ROS1 (proto-oncogene ج-روس الخيارين 1؛ 8) والمقصود بالصندوق (ترتيبها خلال proto-oncogene تعداء؛ 8 المتغيرات). وقد تم تحسين سير العمل معالجة العينة حيث أن نتائج الاختبار يمكن أن تتولد دائماً خلال 72 ساعة استلام العينة.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

كشف تعميم الحمض النووي الريبي (كرنا) من الدم حاجة غير ملباة في التشخيص السريري. هنا يمكننا وصف الأساليب التي تميز كرنا من مرضى سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة استخدام حساسة ومحددة الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل. الاختبارات تلبية متطلبات التصميم للكشف عن المتغيرات الانصهار في غضون 72 ساعة.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

الكمية التصور والكشف عن سرطان الجلد باستخدام التصوير الحراري الديناميكي

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

اختبار الإجهاد ترير الاجتماعي بروتوكول لإحداث الضغط النفسي

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

وα الاختبار: رابيد تعداد CD4 خالية من الخلايا عن طريق اللعاب الجامعة

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

كيرينكوف التصوير التلألؤ (CLI) لرصد علاج السرطان

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

تقييم إفراغ المعدة في الفئران من السكري غير البدناء باستخدام [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-الأوكتانويك اختبار التنفس حمض

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

تشخيص الرواية في مراجعة تقويم مفاصل: زرع Sonication ومتعدد تفاعل البوليميراز المتسلسل

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

امتحان الذوق: اختبار قصيرة، وتم التحقق من صحتها

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

التقليدية درب جعل اختبار تعديل إلى أدوات التقييم العلامة التجارية الجديدة: الرقمية والمشي درب جعل اختبار

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...