Name: a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Vi takker vores samarbejdspartnere, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar og Dr. Samantha Cooper fra Digital biologi Center (Bio-Rad Inc. CA) for deres design, assay støtte; Nezar Rghei og Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Canada) for kritiske rådgivning når du optimerer RNA udvinding protokol; og Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello og Joellyn Enosh for bistand med test krav og kommercielle overvågning.

Producenter vejledningen følges for de reagenser, der er anført nedenfor, medmindre andet beskrevet. PCR-assays er kommercielt tilgængelige produkter designet til at opdage ROS1 og RET fusioner.
1. arbejde med RNA som forberedelse til Reverse transkription (RT)-dPCR: laboratorium bedste praksis
<ol><li>Oprette en RNase-frit miljø, når du arbejder med RNA.<ol>
<li>Bruge kommercielt tilgængelige sprays designet til at inaktivere kontaminerende RNases.</li>
		<li>Brug certificeret fri for RNase reagenser, tips og rør. Brug barriere tips til multikanalpipetter for at forhindre indførelsen af RNases eller krydskontaminering af prøver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Altid bære en laboratoriekittel for at forhindre, at partikler falder fra tøj til din prøve. Udpege en lab coat specifikt til brug med RNA forarbejdning.</li>
	<li>Bære handsker for at forhindre prøve forurening fra RNases i huden. Ændre handsker hyppigt. Bemærk: Antage laboratorium overflader er forurenet med RNase, da de er udsat for miljøet. Handsker, der kontakt hud, hår, doorknobs, fryser håndtag, penne/markører, etc. antages at ikke længere være RNase-fri.</li>
	<li>Dekontaminering multikanalpipetter, benchtops, centrifuger og andre arbejde overflader med en RNase inaktivering spray før brug.</li>
	<li>Hvis det er muligt, opretholde et sæt af udstyr til brug med RNA.</li>
	<li>Minimer forstyrrelser af luft flow i lab områder, når du arbejder med RNA prøver at forhindre partikler fra falder i prøver eller forurener arbejdsområdet.</li>
	<li>Butik renset RNA på-80 ˚C.</li>
	<li>Undgå flere fryse-tør af RNA prøver, da dette kan forårsage nedbrydning.</li>
</ol>2. generation af analytiske RNA materiale for den Positive kontrol
<ol><li>Design syntetiske DNA bruger offentliggjort mRNA sekvenser for fusion varianter af interesse10.<ol>
<li>For en given fusion variant, Vælg et mRNA fusion sekvens, der omfatter fusion site plus tilstrækkelig lang tids flankerende hver side til at dække PCR-amplikon.</li>
		<li>Vælg nukleotidsekvenser mellem 50-250 nt til at efterligne størrelse af cirkulerende RNA fanget ved hjælp af trombocyttal beriget plasma.</li>
		<li>Tilføje en T7 promotor sekvens (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') til 5'-enden af target sekvens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestil syntetiske sekvenser som dobbelt strandede deoxyribonukleinsyre (DNA) fragmenter.</li>
	<li>Rekonstruere syntetiske DNA i Tris-EDTA (TE) buffer til en slutkoncentration på 10 ng/µL.</li>
	<li>Konvertere 60 ng syntetiske DNA til RNA ved hjælp af in vitro- transskription.</li>
	<li>Rense RNA udskrifter ved hjælp af fenol/guanidin-baserede reagens12.<ol>
<li>Omfatter DNase jeg RNase-fri til at fjerne resterende skabelon DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Måler koncentrationen af renset in vitro- RNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig fluorometer med RNA-specifikke farvestoffer og standarder. Sikre, at RNA inden for det interval, der er acceptabel for de valgte standarder. Fortynding kan være påkrævet.</li>
	<li>Bekræft vellykket transskription af gelelektroforese ved hjælp af en 2%-agarosegel, blandet med RNA gel pletten og en høj vifte RNA ladder herunder 50-250 nt størrelsesområde.<ol>
<li>Belastning 500 ng af hver in vitro- RNA på en gel.</li>
		<li>Kør gelen på 5 V/cm.</li>
		<li>Visualisere enkelt bands ved belysning, og dokumentere resultaterne.</li>
		<li>Bekræfte forventede udskrift størrelse for hver af de fusion varianter (baseret på design i trin 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekræfte påvisning af hver in vitro- RNA af RT-dPCR ved hjælp af matchede variant-specifik PCR assay (Se trin 5-8 i denne protokol).</li>
	<li>Valgfrit: Forbered en equimolar blanding af in vitro- RNA, der indeholder hver af fusion varianter og kontrol gen GUSB.</li>
	<li>Hvis trin 2.9 udføres: bekræfte påvisning af fusion varianter inkluderet i kontrol blanding af dPCR ved hjælp af variant-specifik PCR assays (Se trin 5-8 i denne protokol).</li>
	<li>Bestemme ønskede input koncentration for analytiske positive kontroller ved at teste koncentrationer spænder fra 0,25 til 2,5 fg10. Vælg koncentration baseret på ønskede kopi nummer output.</li>
	<li>Efter bekræftelse, skal du forberede 10 µL engangsbrug delprøver af analytiske RNA til brug i den positive kontrol (trin 4.4) og butik på-80 ˚C.</li>
</ol>3. donor prøver
<ol><li>Indsamle 10 mL humant fuldblod prøver i 10 mL blod indsamling rør (BTT) indeholdende en celle-fri RNA konserveringsmiddel. Bemærk: Alle menneskelige donorer skal samtykke til forskning brug og ingen donor-specifikke identificerende oplysninger indsamlet eller brugt under testen.</li>
	<li>Behandle hele blodprøver inden for den tidsramme, der er angivet af BTT fabrikanten.</li>
	<li>Poolede normalt humant plasma kan købes fra en kommerciel kilde til brug inden for den analytiske positive kontrol. Forberede engangsbrug, 1 mL alikvoter af poolede normalt humant plasma og butik på-80 ˚C til brug med den positive kontrol (trin 4.4).</li>
</ol>4. genvinding af cirkulerende RNA fra Plasma
Bemærk: Det er vigtigt at arbejde hurtigt i løbet af denne procedure.
<ol><li>Der centrifugeres fuldblod rør ved 200 x g i 20 min.</li>
	<li>Indsamle op til 4 mL af plasma fra centrifugeret blod collection tube ved hjælp af en serologisk pipette. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre eller Aspirér buffy coat lag.</li>
	<li>Isolere cirkulerende RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, der kan fange exosomes, blodplader og celle-fri RNA fra plasma. Isolere RNA fra positive kontrolprøve sammen med hver enkelt batch.</li>
	<li>
Forberede den Positive kontrol for hvert parti af kliniske prøver som følger:
	<ol>
<li>Tø 1 mL samles normalt humant plasma alikvot (trin 3.3).</li>
		<li>Tø 10 µL analytiske RNA delprøve (trin 2.12).</li>
		<li>Forbered positiv kontrol ved at tilføje 10 µL analytiske RNA i normalt humant plasmaprøve når ethanol er blevet føjet til plasma lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elueres prøver med 100 µL nukleasen-gratis vand. Fortsætte straks med RNA oprydning og koncentration.<ol>
<li>Prøver kan være gemt på våde is, og dækket op til en time.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koncentrere RNA ved hjælp af kolonne baseret metode og elueres i 9 µL af RNase-fri vand.<ol>
<li>Straks gå videre til trin 5, eller holde prøver på våde is i op til en time.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. reverse transkription af RNA til cDNA
<ol><li>Konvertere koncentreret cirkulerende RNA prøven til cDNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig reverse transkription reaktion kit, herunder tilfældige primere (Se tabel 1 for komponenter). Bemærk: Gen specifikke primere er valgfri og kan være designet til test varianter. Primere er designet baseret på target RNA sekvens. Bruge fusion variant sekvenser fra trin 2.1.<ol>
<li>Omfatter ikke reverse transkriptase kontrolprøve og ingen RNA kontrolprøve (Se tabel 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolere cDNA fra reverse transkription reaktion ved hjælp af en kommercielt tilgængelig DNA koncentrator spin kolonne. Bemærk: Dette trin letter fjernelse af enzymer, primere og gratis deoxynucleotide triphosphates (dNTP'er).</li>
	<li>Bruge cDNA straks i PCR reaktioner eller gemme på-80 ˚C.</li>
</ol>6. digital PCR
Bemærk: Denne PCR er specifikke for slipværktøj digital PCR (Se Tabel af materialer).
<ol><li>
PCR mix forholdsregler.
	<ol>
<li>Brug en engangs lab coat og nitril handsker.</li>
		<li>Brug PCR Bland reagenser i en dedikeret reagens forberedelse område. Kan ikke håndtere cDNA i området kun reagens-forberedelse.</li>
		<li>Dække sonder mens arbejder for at beskytte dem mod lys. Overdreven lys kan foto afblege det fluorescerende farvestof knyttet til sonden.</li>
		<li>Transportere blander, er omfattet og beskyttet mod lys, i en separat præ forstærkning området før cDNA der skal tilføjes.</li>
		<li>Tilføje cDNA skal testes til PCR mix i en PCR ren hood ligger i pre forstærkning område.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede en endelig reaktion volumen af 20 µL ifølge tabel 2PCR blander.</li>
	<li>Distribuere PCR blander + cDNA PCR plader. Bemærk: Brug af en plade layout som en guide anbefales.</li>
	<li>Dække pladen ved hjælp af en flytbar plade sealer.</li>
	<li>Der centrifugeres plader kort at indsamle prøver i bunden af brøndene.</li>
	<li>Mix på plade shaker på en lav indstilling for 10 s.</li>
	<li>Der centrifugeres plader kort at indsamle prøven i bunden af brønden.</li>
	<li>Fjern pladen sealer. Udføre droplet generation PCR-cDNA blanding med enten en manuel eller automatiske droplet generation system.<ol>
<li>For manuel droplet generation, overføre 20 µL PCR mix til prøven brønde på droplet generation patron. Tilføje 70 µL af droplet generation olie. Dække med gummi pakning og overførsel patron til manuel droplet generator at indlede droplet generation. Efter droplet generation, overføre dråber til en frisk PCR plade ved hjælp af tips anbefalet af fabrikanten. Opsug og dispensere dråber langsomt, over 5-6 s hver, uden at røre ved åbningen af tip til droplet patron eller plade.</li>
		<li>Automatiseret droplet generation, forsegle pladen med en folie segl og overførsel til droplet generator. Sikre alle tips, patroner, og pladerne på plads før du starter droplet generation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Følgende droplet generation og overførsel af dråber til en frisk PCR-plade, forsegle med en folie plade sealer og varmecyklus plader ved hjælp af indstillingerne i tabel 3.</li>
	<li>Efter den termiske cycler er run komplet, læse pladen ved hjælp af et slipværktøj læser. Oprette en plade layout for reader-software, der identificerer placeringen af kontrolelementer, prøver, osv., og belastning i software til at begynde at læse.</li>
</ol>7. dataanalyse og anmelde og Generation af resultater
<ol><li>Analysere plade læse resultater ved hjælp af kommercielt tilgængelige software.</li>
	<li>Navigere til menuen analyser til at få vist todimensionale (2D) amplitude parceller.</li>
	<li>Vurdere den samlede kvalitet af data ved at undersøge droplet data.<ol>
<li>Evaluere data for samlede accepterede begivenhed tal ved hjælp af menuen begivenheder. Hvis der er færre end 10.000 arrangementer pr. brønd, omhyggeligt evaluere dataene for yderligere problemer.</li>
		<li>Kontrollere data for afvigende fluorescens amplituder. Betydelig amplitude forskelle og koncentration forskelle mellem Kontraprøverne, der udtages tyder på dårlig håndtering eller blanding af prøver.</li>
		<li>Gøre noter af droplet klynger med spray mønstre på en 45-graders akse, hvilket er tegn på dårlig kvalitet dråber eller problematisk prøver.</li>
		<li>Undersøge positiv kontrol, ingen Reverse transkriptase (No RT) og ingen RNA kontrol (NRC) data først. Vælg alle kontrolprøver og undersøge klynge kvalitet af 2D plot. For ordentlig tærskel, skal en klar adskillelse mellem droplet klynger være synlige.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hvert assay angive variant, den tærskel, der er baseret på kontrolhullerne.<ol>
<li>Angiv tærsklerne på 2D parceller ved hjælp af værktøjet sigtekorn for at adskille dobbelt negativ droplet befolkning fra kontrol gen befolkning (mærket med 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite sonde), y-aksen og variant gen befolkning, hvis til stede) mærket med fluorescein amidite OR 6-carboxyfluorescein sonde), x-aksen.</li>
		<li>Summen kopier fra hver Repliker godt for en enkelt prøve.</li>
		<li>Express testresultater som antallet af variant kopier opdaget. Bemærk: Til at bestemme den analytiske cutoff værdien til at kalde en positiv eller negativ prøve, køre en normal sund donor prøve sæt (mindst 10 enkeltprøver) gennem færdiggjort processen og etablere cutoff over nogen påviselig baggrund signal for mutation af interesse. Derudover fastlægge antallet af genet T5 forpligtet til at kalde et positivt eller negativt resultat. Denne kontrol gen cut-off fungerer som en intern kvalitetskontrol (QC) at vurdere mængden og kvaliteten af hvert RNA stikprøve, der er behandlet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. verifikation af RT-dPCR reaktionsbetingelser ved hjælp af cellelinjer (valgfri)
<ol><li>Du kan kontrollere påvisning af fusion varianter, bruge kommercielt tilgængelige cellelinjer udtryk for ROS1 eller RET fusion mRNA af interesse. Fortsættes som følger:<ol>
<li>Homogeniseres flash-frosset celler i en guanidinium-baseret lysis løsning direkte fra frossen tilstand. Selv korte optøning inden homogenisering kan forårsage RNA nedbrydning og tab.</li>
		<li>Isolere RNA ved hjælp af silica-membran spin kolonner designet til RNA.</li>
		<li>Mål koncentrationen af RNA prøver ved hjælp af en fluorometer med RNA-specifikke reagenser og standarder.</li>
		<li>Fortynd isolerede RNA i en baggrund af wild-type RNA fra plasma eller en anden kommerciel kilde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Udføre trin fra Reverse transkription af RNA til cDNA, Digital PCR, og analyse af Data og anmeldelse, og Generation af resultater i denne protokol at bekræfte påvisning af den ønskede variant.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

H.M., Larsens, K.A. og Gap er medarbejdere i og besidder aktier i Biodesix, Inc. H.M., Larsens og Gap er co opfindere på et patent ansøgning indgivet af Biodesix, der dækker en diagnostisk testsystem til påvisning af cirkulerende genetiske varianter i ikke-småcellet lungekræft.

RET og ROS1 rearrangementer tilsammen udgør ~ 3% af driver mutationerne i NSCLC befolkning18. Selv om sjældne, er påvisning af disse genetiske ændringer afgørende. NSCLC patienter med disse ændringer kan drage fordel af målrettede therapeutics, der specifikt hæmmer den afvigende kinase aktivitet, at resultaterne fra Kræftpsykologisk-protein13. Nogle sådanne behandlinger er allerede godkendt af FDA til brug i ROS1 positive NSCLC, mens andre har vist sig for at være effektiv mod RET i kliniske forsøg19.
Digital PCR teknologien giver følsomhed, der er ideel til flydende biopsi programmer20. Der har været betydelige vedtagelse af denne teknologi til brug med cirkulerende celle-gratis DNA til måling af tumor mutationer hos patienter med NSCLC4,6,21,22,23 . Ud over cfDNA udviklede vi en protokol, der er designet til robuste måling af de mest udbredte fusion varianter hos patienter med NSCLC fra cirkulerende tumor RNA (fig. 1A)10.
Vores etableret protokol giver mulighed for analytisk påvisningsgrænser ned til 0,2% (figur 2). Mens RT-dPCR er usædvanlig særlige og følsomme, er assays begrænset til panelet af kendte fusion varianter, der er valgt og multipleksede til påvisning i PCR assay. Således skal fusioner skal medtages i multipleksede assays vælges omhyggeligt at sikre ordentlig dækning i population af patienter med NSCLC. Vi har med succes udviklet assays til RET og ROS1 der samtidig registrerer otte fusion varianter resulterende fra rearrangementer af RET eller ROS1 loci og dækker 99% og 88% af den RET og ROS1 positive befolkning, henholdsvis (figur 1B-C )17.
Den endelige test arbejdsproces som beskrevet i denne undersøgelse omfatter batch kontrol for at sikre konsistens af resultater. Disse kontrolelementer omfatter både en positiv analytiske standard samt to negative kontroller, der i fællesskab sørge for der er ingen forurening eller PCR hæmning indtræffer inden for batch (figur 3). For at sikre robusthed af analysen, blev en undersøgelse udført ved hjælp af batch kontrol over en 21-dages periode (figur 3D, H). Disse data at påvise sammenhængen af RNA-processen som fastsat i denne protokol.
God laboratorie praksis og passende RNA håndtering er centrale elementer til at sikre robuste og præcise resultater. Laboratorie plads og udstyr dedikeret til brug med RNA, rengøring af udstyr efter hver brug, ved hjælp af RNase-fri reagenser og forbrugsvarer, og anvender en RNase inaktivering spray til arbejdsplads alle bidrage til at reducere forurenende RNases. Omhyggelig håndtering af RNA prøver af teknikere, herunder en dedikeret laboratoriekittel, hyppige handske ændringer, arbejder hurtigt gennem ekstraktionsmetode RNA og holde prøver på is er af yderste vigtighed at bevare prøve integritet. Når RNA er blevet omvendt transskriberet til cDNA, er prøven i en mere stabil form, der er mindre udsat for nedbrydning. Ud over praksis, der understøtter RNA integritet, bør PCR komponenter og prøver opretholdes i adskilte områder for at undgå krydskontaminering, der kan føre til falsk-positive resultater. Stock PCR-reagenser og forberedelse af PCR master mix bør holdes adskilt fra PCR skabeloner og stor omhu bør tages til at adskille forstærket skabelon (post-PCR) fra alle pre forstærkede materialer herunder reagenser, RNA og cDNA prøver. Endelig, ordentlig generation og håndtering af emulgerede PCR blander før forstærkning er central for vedligeholdelse dråben integritet og optimale dPCR betingelser. Forholdsregler som disse er kritisk under udførelsen af denne protokol til at opnå ensartede og præcise resultater. Alle data bør undersøges af uddannet personale før udgivelsen af resultater være sikker på at alle QC målinger er blevet opfyldt. Ved suboptimale resultater (figur 4), kladden skal revideres af teknisk personale og laboratorie instruktør og kan kræve genbehandling.
RT-dPCR resultater kan fremstilles så tidligt som i 24 timer fra prøve modtagelsen og 95% af prøveresultater inden for de test, der anvendes i denne undersøgelse (n = 984) blev rapporteret til den bestilling læge i mindre end 72 timer fra modtagelsen (figur 5). Denne turn-around tid giver læger med meget behov for Molekylær information i en tidsramme, der giver mulighed for indledningen af den passende behandling. Disse resultater er typisk tilgængelige tidligere end dem, der opnås ved hjælp af en konventionel væv biopsi. Yderligere biomarkører for NSCLC og andre kræftformer kan udvikles ved hjælp af tilsvarende cirkulerende RNA-baserede metoder, og vil drage fordel af de samme hurtige tid-til-resultater. For eksempel, kunne måling af programmeret død Ligand 1 (PD-L1) mRNA udskrift ved hjælp af RT-dPCR oplyse læger om immunterapi muligheder. Der er også en voksende interesse for nytten af flydende biopsi og dPCR i overvågning for terapeutisk virkning. Tidligere angivelser af genopblussen af tumor ved hjælp af genomisk testning for bestemte varianter kan tillade læger til at justere behandlingsregimer før patienterne er symptomatisk af standard pleje foranstaltninger såsom imaging24. Protokoller som rapporteret i denne undersøgelse er ideel til overvågning på grund af deres ikke-invasiv, følsomhed, hurtig turn-around tid og omkostningseffektivitet. Analysen beskrevet heri giver resultater indenfor 72 timer fra prøven modtagelse med minimal falsk-positive opdagelse takster, som letter hurtig behandling beslutninger og omgår nogle begrænsninger opleves med væv-baserede test4.
Vores protokol og data viser en robust testsystem til identifikation af lav overflod RNA varianter samt potentialet for blod-baserede mutation testning i klinisk praksis. For de patienter, der ikke har en handlingsrettede driver tilgange mutation identificeret ved hurtig målrettet flydende biopsi som denne ene, tilsætning af mere omfattende genomet og proteomet test fra både væv og blod kan give endnu bredere kliniske oplysninger til støtte for planlægning af behandling.

Op til 25% af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kan patienter ikke har tilstrækkeligt væv tilgængelige for afprøvning på tidspunktet for diagnosen. Selv i tilfælde, hvor væv er tilgængelige, kan det ikke i tilstrækkelig mængde eller kvalitet at udføre anbefales molekylære test1,2. I tilfælde hvor der er nok væv fra en biopsi for Molekylær profilering, patienter kan have til at vente flere uger eller længere på resultater, eller begynde behandling uden molekylære resultater3,4. Det er imidlertid afgørende at informative molekylære diagnose være tilgængelige givet fremkomsten af flere målrettede behandlingsmuligheder for patienter med diagnosen NSCLC. Afprøvning af cirkulerende celle-gratis DNA (cfDNA) fra flydende biopsi er en løsning på udfordringerne af traditionelle væv test4,5,6. Nuværende test muligheder for handlingsrettede mutationer i NSCLC ved hjælp af cfDNA og en lignende dPCR-baseret arbejdsgang for hurtigt resultat generation, omfatter epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) sensibiliserende mutationer ΔE746-A750 og L858R, EGFR modstand mutation T790M , KRAS Proto-Oncogene (KRAS) varianter, og B-Raf Proto-Oncogene (BRAF) variant V600E. Selv om ikke så bredt vedtaget af feltet, kan cirkulerende tumor-afledte messenger RNA (mRNA) isoleret fra flydende biopsi også give vigtige kliniske oplysninger7,8,9. Vi har tidligere udviklet og rapporteret om multipleksede påvisningsmetoder pighuder og mikrotubulus forbundet Protein som 4-Anaplastisk lymfom Receptor tyrosin Kinase (EML4-ALK) fusion varianter fra blodplasma10. I denne undersøgelse udvidet vi disse metoder til at omfatte højere-ordens multipleksede RNA mål for ROS1 og RET, der dækker otte fusion varianter i hvert assay. Formålet var at udvikle en hurtig, følsomme, specifikke og reproducerbare teknik til påvisning af disse fusion varianter fra plasma af patienter med tidligere diagnosen NSCLC.
Testprocessen er indledt i en læge kontor ved hjælp af RNA stabilisere blodet indsamling rør11. Disse rør indeholder en celle konserveringsmiddel samt RNase hæmmere. Prøverne er afsendt prioritet natten til de centraliserede College af amerikanske patologer CAP-akkrediteret/klinisk laboratorium forbedring ændringsforslag (CLIA)-certificeret laboratorium (Clinical Laboratory) til behandling af kompetent personale. Når modtaget af den kliniske laboratorium, er hvert trin af behandlingen gennemført under godkendte Standard Operating Procedures (SOP). Fuldblod centrifugeres for at inddrive plasma, som derefter bruges til at isolere cirkulerende RNA, der er enten gratis i blodet eller inden for indkapsling fraspaltning, såsom exosomes og blodplader7,8,9. For at isolere RNA fra disse rum, valgte vi systemet for RNA opsving baseret på sammenligninger af flere udvindingsmetoder. Den isolerede RNA er koncentreret og omvendt transskriberet til cDNA. Flere reverse transkriptase enzymer og gen-specifikke primere blev evalueret under optimering af cDNA syntese metode til at maksimere ROS1 og RET target udskrift konvertering10. Dette er kritisk for lav overflod udskrifter, såsom tumor-afledte fusion varianter i omløb. Endelig, vi optimeret dPCR primer og sonde koncentrationer at tillade multipleksede påvisning af RET eller ROS1 fusion varianter og kontrol-genet, glucuronidasesystemer-β (GUSB). Vi kombineret så de bedste betingelser fra hver af undersøgelserne, optimering i en låst slutprotokollen før du udfører analytisk valideringsundersøgelserne beskrevet i denne betænkning. Denne protokol og disse resultater danner grundlag for en hurtig og følsomme arbejdsproces til rutinemæssig påvisning af sjældne fusion varianter i omløb.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

Vi har udviklet nye metoder til isolering og karakterisering af tumor-afledte cirkulerende ribonukleinsyre (cRNA) for blod-baseret flydende biopsi. Robust påvisning af cRNA inddrives fra blod repræsenterer en løsning til en kritisk udækket behov i klinisk diagnostik. Testen begynder med samling af fuldblod i blod indsamling rør der indeholder konserveringsmidler, at stabilisere cRNA. Celle-fri, exosomal og trombocyttal-associerede RNA er isoleret fra plasma i denne testsystem. CRNA er omvendt transskriberet til supplerende DNA (cDNA) og forstærkes ved hjælp af digital polymerase kædereaktion (dPCR). Prøver evalueres for både mål biomarkør samt et kontrol-genet. Test validering inkluderet grænsen afsløring, nøjagtighed og robusthed undersøgelser med analytiske prøver. Den metode, der er udviklet på baggrund af disse undersøgelser reproducerbar opdage flere fusion varianter for ROS1 (C-Ros proto-oncogene 1; 8 varianter) og RET (omarrangeret under Transfektion proto-oncogene; 8 varianter). Prøve behandling workflow er blevet optimeret således, testresultater kan konsekvent genereres inden for 72 timer efter prøven modtagelse.

Denne protokol beskriver et testsystem udviklet til påvisning af RNA fusion varianter til brug i måling af driver mutationer i plasma af NSCLC patienter (fig. 1A). Fusion mRNA produkter fra udtryk for de mest almindelige RET og ROS1 rearrangementer i NSCLC befolkning blev identificeret13,14,15,16,17. Multiplex-PCR assays blev derefter designet til at opdage de otte mest almindelige udskrift varianter for hvert mål i NSCLC inden for en enkelt reaktion. De mest almindelige omplantninger på ROS1 locus generere foreninger med 5' dele af CD74, SDC4, SLC34A2, EZR eller TPM3 gener (figur 1B). De mest almindelige omplantninger på RET locus føre til sammenstilling med KIF5B, som analysen dækker seks exon vejkryds. Ekstra RET partnere, der er omfattet omfatter dem med CCDC6 og TRIM33 (figur 1C). I alt assays dække ca. 88% af ROS1 og 99% af RET ændringer vides at forekomme i NSCLC patientgruppe17.
Specificiteten af assay komponenter blev først vurderet ved hjælp af otte individuelle i vitro RNA'er, der indeholder mRNA-sekvensen for fusion udskrifter er omfattet af ROS1 eller RET multipleksede assays. Hver RNA art blev testet imod hver enkelte variant assay, der omfatter den multipleksede version. Der var ingen krydsreaktivitet af disse assays, således demonstrere 100% analytiske specificitet i det designede multipleksede assays (data ikke vist). For at bestemme den nedre grænse for påvisning af forsøgsprotokollen, total RNA afledt af cellelinjer udtrykker en fusion variant inkluderet i analysen var blandet ind i en baggrund af normale RNA på 5%, 1%, 0,2% og 0,04% koncentrationer. De multipleksede RET og ROS1 variant PCR assays opdaget så lidt som 0,2% fusion variant (figur 2A-B). Derudover en forberedelse af 5% off-target cellelinie afledte RNA (give udtryk for en EML4-ALK fusion udskrift) ikke der blev registreret med de multiplex ROS1 og RET assays, yderligere demonstrerer specificitet (figur 2A-B).
Precision afprøvning af RT-dPCR processen blev udført for både ROS1 og RET. analytisk kontrolmateriale bestod af equimolar i vitro RNA'er blev behandlet på tre koncentrationer (høj, Medium og lav) gennem reverse transkription og dPCR på tre forskellige gange inden for samme dag (intra-dag), på tre på hinanden følgende dage (inter dag), og med to operatører (inter operator). Resultater fra præcisions-testningen demonstreret nøjagtig påvisning af både fusion udskrift af interesse, såvel som en kontrol gen, GUSB, der er medtaget som en intern QC metriske (figur 2 c-D).
Ud over GUSB intern kontrol, blev hver batch af kliniske prøver kørt med en række batch kontrol. Positiv kontrol blev udviklet fra en blanding af analytiske in vitro RNA, der repræsenterede fusion varianter testet i RT-dPCR, samt analytiske in vitro- RNA for GUSB. Denne RNA blev tilsat i normalt humant plasma lysate under RNA udvinding og blev behandlet sammen med de kliniske prøver i hele protokollen. Kontrolelementet ingen reverse transkriptase (No RT) var en negativ kontrol at bekræfte fravær af kontaminerende materiale i RNA udvinding arbejdsproces og demonstrere specificiteten af primere til RNA. Kontrolelementet ingen RT blev genereret ved hjælp af samme materiale som den positive kontrol, men det omfatter ikke enzym i cDNA syntese reaktion. Ingen RNA kontrol (NRC) er en negativ kontrol at bekræfte fravær af kontaminerende udskrifter i reverse transkription reaktion komponenter. Denne kontrol blev indført i arbejdsprocessen på trinnet cDNA syntese, og vandet blev tilføjet i reaktionen i stedet for en RNA skabelon. Kontrolelementerne ikke RT og NRC skal være negativt i begge kanaler, hvis nøjagtige resultater skal være leveret. Tabel 1 viser reverse transkription reaktion komponenter for hver kontrol. Eksempler på de 2D afbildninger for hver af disse objekter er vist for ROS1 (fig. 3 A-C) og RET (figur 3 E-G) multiplex assays. Fusion varianter blev fundet ved hjælp af en fluorescein amidite (FAM) sonde og er repræsenteret langs y-aksen, mens kontrol gen, GUSB, blev fundet ved hjælp af en 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX) sonde og på x-aksen. Disse batch kontrol blev vurderet i løbet af 21 dage til at bestemme assay robusthed. Fusion positive dråber og GUSB kontrol gen dråber blev observeret for ROS1 og RET i alle 21 kører henrettet i løbet af undersøgelsen (figur 3D, H). Alle negative kontroller (No RT og NRC) givet negative resultater på tværs af de hele 21 dage (data ikke vist).
Evnen til at foretage fejlfinding af er en kritisk del af nogen testprotokol skal køres i den kliniske laboratorium indstilling. Her, giver vi virkelige verden eksempler på sub-optimale resultater ved hjælp af RT-dPCR-protokollen. Først er en eksempel 2D plot demonstrerer betydningen af ingen reverse transkriptase kontrol (figur 4A). I dette eksempel var mutant positive dråber til stede selv om der var ingen cDNA konvertering skyldes manglende enzym. Dette resultat var sandsynligvis på grund af dPCR primere forstærke off target genomisk DNA. I dette tilfælde vil udformning af en intron-spænder assay forhindre forstærkning af genomisk DNA. Alternativt, et RNase-fri DNase enzym kan bruges til at fjerne forurenende DNA, men dette kan ikke anbefales til påvisning af sjældne mål, som nogle RNA nedbrydning kan forekomme under inkubation med enzymet. Det næste eksempel 2D plot var en NRC med positive dråber i begge kanaler (fig. 4B). Dette tydede forurening på et tidspunkt i opsætningen af RT-dPCR. I dette tilfælde er anbefalingen at kassere alle potentielt kontaminerede reagenser, der anvendes i test, grundigt rense alt udstyr, og teste igen med frisk reaktion komponenter. Det tredje eksempel 2D plot præsenteret som en spray af dråber langs en 45° linje (figur 4C). Dette er ofte forårsaget af klipning og coalescing dråber. Omhyggelig dråbe håndtering forud termisk cykling er væsentlige, som dråber er tilbøjelige til at skade. Vi anbefaler brug af automatiserede droplet generation, når de er tilgængelige. Hvis overførsel af manuelt genereret dråber, være sikker på at vælge de anbefalede wide-bore tips og ansætte omhyggelig pipettering teknik. Dråbe overførsel kræver langsom aspiration og udlevering, med hver finder sted over 5-6 sekunder, og det er vigtigt at pipette tip åbning ikke røre droplet patron eller godt. Når udlevering, holde pipette tip på den flydende niveau og hæve det langsomt som dråber er udleveres (Se video til demonstration). Den endelige 2D plot eksempel viser en manglende adskillelse mellem positive og negative droplet populationer (figur 4D). Dette kan have flere årsager. Stærke PCR-hæmmere, såsom rengøringsmidler anvendes i lysis buffere og et overskud af stærkt nedbrudte DNA, kan medføre tab af adskillelse. I dette tilfælde overveje at tilføje en oprydning trin mellem cDNA syntese og dPCR (som beskrevet i trin 5 i denne protokol). Endelig, manglende adskillelse kan også være på grund af sub-optimale forstærkning betingelser, og optimering af PCR skridt bør også overvejes.
Data i figur 5 repræsenterer 984 virkelige verden patienten prøve turn-around tid og viser den hurtige karakter af denne test arbejdsproces. Resultaterne blev indberettet til den behandlende læge så tidligt som inden for 48 timer (79% af tilfældene) prøve modtagelsen og i 95% af tilfældene, inden for 72 timer. Afslutningsvis, kan brug af stabiliseret cirkulerende RNA blod indsamling rør, optimeret RNA ekstraktion procedurer fra blod og RT-dPCR kører efter en optimeret protokol med de relevante interne og batch kontrol, give en hurtig testsystem for nøjagtig påvisning af fusion RNA varianter relevante i NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Figur 1 : Oversigt over blod prøve behandling trin for Fusion Variant påvisning ved hjælp af Assays specifikke til den mest udbredte RET og ROS1 varianter i NSCLC. (A) stikprøvekontrol startes når fuldblod er trukket og en BTT er afsendt inden for modellen samling kit til den kliniske laboratorium. Cirkulerende RNA er inddrives fra flere kilder i trombocyttal beriget plasma, reverse transskriberet med gen specifikke priming og renset til brug i dPCR. Prøverne behandles ved hjælp af en kommercielt tilgængelig system, som består af droplet generation (emulsion), forstærkning, og slipværktøj optælling. Data er analyseret ved hjælp af kommercielt tilgængelige software. Testresultaterne er derefter dokumenteres og rapporteres tilbage til test-anmodende læge. Processen er designet til at arbejde inden for en tidsramme på 72 timer fra prøve modtagelsen til resultatet udgivelse. Otte varianter til (B) ROS1 og (C) RET dækkes inden for de multipleksede assays. Tilpasset fra Biodesix website med tilladelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Figur 2 : Analytiske validering. Celle-linjer giver udtryk for (A) SDC4-ROS1 fusion og (B) CCDC6-RET fusion blev fortyndet i en baggrund af samlede menneskelige vildtype RNA (WT RNA). Med hver fusion variant grundlagt påvisningsgrænsen på 0,2% variant frekvens ved hjælp af foruddefinerede kriterier for hver variant assay. Alle prøver over denne tærskel også indeholdt mindst 21 eksemplarer af kontrol gen. 5% EML4-ALK (ALK) standard i en baggrund af wild-type RNA blev testet for at demonstrere assay specificitet, hvilket blev bekræftet af et negativt resultat. Analytiske multipleksede RNA standarder blev målt på høj, medium, og lav koncentration (C) ROS1 og (D) RET. præcision blev evalueret over tre kører på den samme dag (Intra-dag), tre kører på tre på hinanden følgende dage (inter dag), og med to uafhængige operatører (inter operator). Kopi nummer og standardafvigelser er vist. Tilpasset fra Biodesix website med tilladelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Figur 3 : Batch Processing kontrol eksempler og robusthed Data. 2D plot af ROS1 multipleksede assay dPCR resultater af (A) positiv kontrol, (B) ingen reverse transkriptase kontrol, og (C) ingen RNA skabelon kontrol. (D) kontrol blev kørt på 21 dage i træk (undtagen weekender og helligdage). Betyde eksemplarnummer +/-standardafvigelserne for ROS1 positive kontrol var 439 +/-141. Ingen reverse transkriptase og ingen skabelon kontrol var også køre hver dag, og disse var alle negative (data ikke vist). 2D plot af RET multipleksede assay dPCR resultater af (E) positiv kontrol, (F) ingen reverse transkriptase kontrol og (G) ingen RNA skabelon kontrol. (H) kontrol blev kørt på 21 dage i træk (undtagen weekender og helligdage). Betyde kopier +/-standardafvigelser for RET positiv kontrol var 586 +/-182. Ikke vist er ingen reverse transkriptase og ingen skabelon kontrolelementer, der også køres på hver dag og var alle negative. Tilpasset fra Biodesix website med tilladelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Figur 4 : Fejlfinding RT-dPCR. 2D observationsområder repræsenterende sub-optimale dPCR resultater opnås, når der er (A) forurening i den ingen reverse transkriptase kontrol, (B) forurening i den ingen RNA kontrol, (C) klipning og sammensmeltende af dråber og (D ) dårligt optimeret PCR betingelser eller PCR hæmning. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Figur 5 : Ekspeditionstid (TAT). TAT (i timer) var udarbejdet til tests anmoder om en RNA variant (n = 984). Data udelukker weekender, helligdage og prøver afholdt > 24 h på grund af ufuldstændige kliniske oplysninger om laboratorie Test anmode former. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tabel 1: Forberedelse af reagenser til Reverse transkription for proceskontrollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix for sonder (ingen 2'-deoxyuridine 5'-trifosfat)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x variant target primere/sonder sæt (450 nmol/L primere, 250 nmol/L FAM sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x kontrol mål primere/sonden sæt (450 nmol/L primere, 250 nmol/L HEX sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>nukleasen-frit vand</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Forberedelse af master mix for dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cykling trin</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
			<td># Cykler</td>
			<td>Rampe sats</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym aktivering</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Udglødning/udvidelse</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym deaktivering</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hold (valgfri)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>uendelig</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Termisk cykel betingelser.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-baseret Test til påvisning af ROS1 og RET Fusion udskrifter fra cirkulerende ribonukleinsyre ved hjælp af Digital Polymerase Chain Reaction

Påvisning af cirkulerende ribonukleinsyre (cRNA) fra blodet er et udækket behov i klinisk diagnostik. Her beskriver vi metoder, der kendetegner cRNA fra ikke-småcellet lungekræft kræftpatienter ved hjælp af følsom og specifik digital polymerase kædereaktion. Prøverne opfylder design at opdage fusion varianter inden for 72 timer.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cellefri CD4 Optælling Anvendelse helspyt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Vurdering af gastrisk tømning hos ikke-overvægtige diabetiske mus ved anvendelse af en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octansyre Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolation og formering af cirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Roman diagnostik Revision artroplastik: implantat ultralydbehandling og Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smag eksamen: En kort og validerede Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Digital PCR for kvantificering af cirkulerende MicroRNA i akut myokardieinfarkt og hjerte-kar-sygdom

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

Traditionel Trail Making test modificeret til helt nye vurderingsværktøjer: Digital og Walking Trail gør test

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...