Name: a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Vi takker våre samarbeidspartnere, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar og Dr. Samantha Cooper fra Digital biologi Center (Bio-radian Inc. CA) for sin analysen design støtte; Nezar Rghei og Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Canada) for kritisk råd når du optimaliserer RNA utvinning protokollen; og Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello og Joellyn Enos for hjelp med test krav og kommersielle overvåking.

Produsentens instruksjoner følges for reagenser nedenfor, hvis ikke annet angis. PCR-analyser er kommersielt tilgjengelige produkter utviklet for å oppdage ROS1 og RET fusjoner.
1. arbeider med RNA i forberedelse for omvendt transkripsjon (RT)-dPCR: laboratorium fremgangsmåter
<ol><li>Opprette en RNase-fritt miljø når du arbeider med RNA.<ol>
<li>Bruke kommersielt tilgjengelige spray designet for å deaktivere forurensende RNases.</li>
		<li>Bruk sertifiserte RNase-fri reagenser, tips og rør. Bruk barriere tips for pipettors for å hindre innføring av RNases eller krysskontaminering av prøver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk alltid en laboratoriet strøk for å hindre partikler falt fra klær din prøve. Angi en lab frakk bestemt å bruke med RNA behandling.</li>
	<li>Bruke hansker for å hindre eksempel forurensning fra RNases i huden. Endre hansker ofte. Merk: Anta laboratorium overflater er forurenset med RNase siden de er utsatt for miljøet. Hansker som kontakt hud, hår, doorknobs, fryser håndtak, penner/markører, etc. antas å ikke lenger være RNase-fri.</li>
	<li>Dekontaminere pipettors, benchtops, sentrifuger og andre arbeidsflater med en RNase inaktivering spray før bruk.</li>
	<li>Hvis mulig, vedlikeholde et sett med utstyr for bruk med RNA.</li>
	<li>Minimere avbrudd på luftstrømmen i lab områder når du arbeider med RNA prøver å hindre partikler fra falle i prøver eller forurensende arbeidsområdet.</li>
	<li>Store renset RNA på-80 grader.</li>
	<li>Unngå flere fryse-thaws av RNA prøver, da dette kan føre til dårligere.</li>
</ol>2. generasjon av analytiske RNA materiale for positivt styrer
<ol><li>Utforme syntetiske DNA publiserte mRNA sekvenser i fusion varianter av rundt10.<ol>
<li>For en gitt fusion variant, velger du en mRNA fusion sekvens som inkluderer fusion nettstedet tillegg tilstrekkelig lengde flankert på hver side å dekke PCR-amplicon.</li>
		<li>Velg nukleotid sekvenser mellom 50-250 nt å etterligne størrelsen av sirkulerende RNA tatt ved hjelp av blodplater-beriket plasma.</li>
		<li>Legg arrangøren T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 ") til 5' slutten av målet sekvensen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestille syntetiske sekvenser som dobbel strandet deoksyribonukleinsyre (DNA) fragmenter.</li>
	<li>Rekonstituer syntetiske DNA Tris-EDTA (TE) buffer til en siste konsentrasjon av 10 ng/µL.</li>
	<li>Konvertere 60 ng syntetiske DNA til RNA bruker i vitro transkripsjon.</li>
	<li>Rense RNA utskrifter med fenol/guanidine-baserte reagens12.<ol>
<li>Inkluderer DNase I, RNase-fri for å fjerne gjenværende mal DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Måle konsentrasjon av renset i vitro RNA bruker et kommersielt tilgjengelig fluorometer med RNA-spesifikke fargestoffer og standarder. Kontroller RNA er innenfor de akseptable for de valgte standardene. Fortynning kan være nødvendig.</li>
	<li>Bekrefte vellykket transkripsjon av gel geleelektroforese bruker en 2% agarose gel blandet med RNA gel flekken og en høy RNA stigen inkludert 50-250 nt størrelsesområde.<ol>
<li>Last 500 ng hver i vitro RNA på en gel.</li>
		<li>Kjøre gel på 5 V/cm.</li>
		<li>Visualisere enkelt band med belysning og dokumentere resultatene.</li>
		<li>Bekrefte forventede transkripsjon størrelse for hver av fusion variantene (basert på design i trinn 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekrefte påvisning av hver i vitro RNA av RT-dPCR med samsvarende variant-spesifikke PCR analysen (se trinn 5-8 i denne protokollen).</li>
	<li>Valgfritt: Forberede en ekvimolare blanding av i vitro RNA som inneholder alle varianter av fusion og kontroll genet GUSB.</li>
	<li>Hvis trinn 2.9 utføres: bekrefte påvisning av hver av fusion variantene inkludert i kontroll blandingen av dPCR bruker variant-spesifikke PCR analyser (se trinn 5-8 i denne protokollen).</li>
	<li>Bestemme ønskede input konsentrasjon for analytiske positivt kontroller ved å teste konsentrasjonene varierer fra 0,25 til 2,5 fg10. Velg konsentrasjon basert på ønskede kopien antall utgang.</li>
	<li>Etter bekreftelse, forberede 10 µL engangs dele analytiske RNA for bruk i positiv kontroll (trinn 4.4) og butikk på-80 grader.</li>
</ol>3. donor prøver
<ol><li>Samle 10 mL menneskelig fullblod prøver i 10 mL blod samling rør (BCT) som inneholder cellen-fri RNA konserveringsmiddel. Merk: Alle menneskelige givere skal samtykke til forskning bruk og ingen donor-spesifikke identifiserende informasjon skal samles inn eller brukes under testing.</li>
	<li>Behandle hele blodprøver i tidsrammen som er angitt av BCT produsenten.</li>
	<li>Grupperte normal humant plasma kan kjøpes fra en kommersiell kilde for bruk i analytiske positivt kontrollen. Klargjør enbrukers, 1 mL dele gruppert normal humant plasma og butikk på-80 grader for bruk med positiv control (trinn 4.4).</li>
</ol>4. gjenoppretting av sirkulerende RNA fra Plasma
Merk: Det er viktig å arbeide raskt under denne prosedyren.
<ol><li>Sentrifuge fullblod rør på 200 x g for 20 min.</li>
	<li>Samle opptil 4 mL plasma fra sentrifugeres blod samling rør med en serologisk pipette. Vær forsiktig med å forstyrre eller Sug opp buffy pels laget.</li>
	<li>Isolere sirkulerende RNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit som kan ta exosomes, blodplater og celle-fri RNA fra plasma. Isolere RNA fra positiv kontroll prøven sammen med hvert parti.</li>
	<li>
Klargjør kontrollen Positive hvert parti av klinisk prøver som følger:
	<ol>
<li>Tine 1 mL samlet normal humant plasma aliquot (trinn 3.3).</li>
		<li>Tine 10 µL analytiske RNA aliquot (trinn 2.12).</li>
		<li>Klargjør positiv kontroll ved å legge 10 µL analytiske RNA i den normale menneskelige plasmaprøve når etanol har lagt til plasma lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elute utvalg med 100 µL nuclease-fritt vann. Fortsette umiddelbart med RNA rydde opp og konsentrasjon.<ol>
<li>Eksempler kan være lagret på våt is, og dekket, i opptil en time.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konsentrere RNA bruker kolonne basert metoden og elute i 9 µL RNase uten vann.<ol>
<li>Gå rett til trinn 5, eller holde eksempler på våt is i opptil en time.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. reversere transkripsjon av cDNA
<ol><li>Konvertere konsentrert sirkulerende RNA prøven til cDNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig omvendt transkripsjon reaksjon kit, inkludert tilfeldige primere (se tabell 1 for komponenter). Merk: Gene bestemt primere er valgfrie og kan utformes for test varianter. Primere er designet basert på målet RNA sekvens. Bruk fusion variant sekvenser fra trinn 2.1.<ol>
<li>Ingen revers transkriptase kontroll prøven og ingen RNA kontroll prøven (se tabell 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolere cDNA fra omvendt transkripsjon reaksjon ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA konsentrator spinn kolonne. Merk: Dette trinnet gjør fjerning av enzymer, primere og gratis deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).</li>
	<li>Bruke cDNA umiddelbart i PCR reaksjoner eller lagre på-80 grader.</li>
</ol>6. digital PCR
Merk: Denne PCR er spesifikk for slippverktøy digital PCR (se Tabell for materiale).
<ol><li>
PCR Bland Forholdsregler.
	<ol>
<li>Bruk en engangs lab frakk og nitril hansker.</li>
		<li>Bruk PCR bland reagenser i en dedikert reagens forberedelse området. Håndter ikke cDNA i området reagens bare forberedelser.</li>
		<li>Dekk sonder mens du arbeider å beskytte dem mot lyset. Overdreven lyset kan Foto bleke fluorescerende fargestoff knyttet til sonden.</li>
		<li>Transportere mikser, dekket og beskyttet mot lys, i et separat pre forsterkning område før cDNA er legges.</li>
		<li>Legge til cDNA skal testes til PCR blanding i PCR ren hette ligger i pre forsterkning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede PCR mikser til et siste reaksjon volum på 20 µL etter tabell 2.</li>
	<li>Distribuere PCR mikser + cDNA til PCR plater. Merk: Bruk av en plate layout som en guide anbefales.</li>
	<li>Dekk platen med en flyttbar plate sealer.</li>
	<li>Sentrifuge kort til å samle inn eksempler på bunnen av brønnene.</li>
	<li>Mix på plate shaker på en lav innstilling for 10 s.</li>
	<li>Sentrifuge kort til å samle inn eksempler på bunnen av brønnen.</li>
	<li>Fjerne plate sealer. Utføre slippverktøy generasjon for PCR-cDNA blanding med enten en manuell eller automatisert slippverktøy generasjon systemet.<ol>
<li>For manuell slippverktøy generasjon, overføre 20 µL PCR mix utvalg brønner på slippverktøy generasjon kassetten. Legge til 70 µL slippverktøy generasjon olje. Dekk med gummi pakning og overføre kassett til manuell slippverktøy generator å starte slippverktøy generasjon. Etter slippverktøy generasjon, overføre dråper til en frisk PCR tallerken med tips anbefalt av produsenten. Sug opp og dispensere dråpene langsomt, over 5 til 6 s hver, uten å berøre åpningen av spissen slippverktøy patron eller plate.</li>
		<li>For automatisert slippverktøy generasjon, sel platen med en folie sel og overføring til slippverktøy generatoren. Sikre alle tips, kassetter, plater er på plass før slippverktøy generasjon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Følgende slippverktøy generasjon og overføring av dråper til en frisk PCR plate, tetning med en folie plate sealer og termisk syklus plater med innstillingene i tabell 3.</li>
	<li>Etter den termiske cycler er kjøre fullført, lese platen ved hjelp av et slippverktøy reader. Lage en plate layout for leseren programvare som identifiserer plasseringen av kontroller, prøver, etc., og laste inn programvare å begynne å lese.</li>
</ol>7. dataanalyse og gjennomgang og generasjon av resultater
<ol><li>Analysere plate lese resultater ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare.</li>
	<li>Klikk på analyser vise todimensjonale (2D) amplituden tomter.</li>
	<li>Evaluere den generelle kvaliteten på dataene ved å undersøke slippverktøy dataene.<ol>
<li>Evaluere data for totalt akseptert hendelsen tall ved hjelp av hendelser-menyen. Hvis det er færre enn 10 000 hendelser per brønn, nøye evaluere data for flere problemer.</li>
		<li>Kontroller dataene for avvikende fluorescens amplituder. Betydelig amplituden forskjeller og konsentrasjon forskjeller mellom Repliker eksempler viser dårlig håndtering eller blanding av eksempler.</li>
		<li>Gjør notater av slippverktøy klynger med spray mønstre på en 45-graders akse, som er et tegn på dårlig kvalitet dråper eller problematisk prøver.</li>
		<li>Undersøke Positive kontroll, ingen revers transkriptase (ingen RT) og nei RNA kontroll (NRC) først. Velg alle kontroll prøver og undersøke klynge kvalitet av 2D tomten. For riktig terskelverdi være et klart skille mellom slippverktøy klynger tydelig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hver analysen angi varianten, terskelen basert på kontroll brønner.<ol>
<li>Angi terskler på 2D tomter bruke verktøyet trådkorset skille befolkningen dobbel negative slippverktøy fra kontroll genet befolkningen (merket med 5-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite sonde), y-aksen og variant genet befolkningen, hvis presentere) merket med fluorescein amidite OR 6-carboxyfluorescein sonde), x-aksen.</li>
		<li>Sum kopierer fra hver Repliker brønn for et enkelt utvalg.</li>
		<li>Uttrykke testresultater som antall variant eksemplarer ble oppdaget. Merk: Bestemme en analytisk avkuttet verdi for å kalle en positiv eller negativ prøve, kjøre en normal frisk donor utvalg sett (minst 10 personlige prøver) gjennom endelige prosessen og etablere cut-off over alle detectable bakgrunn signal for mutasjon av interesse. I tillegg opprette antallet kontroll genet Kopier må et positivt eller negativt resultat. Denne kontrollen genet cut-off fungerer som en intern kvalitetskontroll (QC) å vurdere kvantitet og kvalitet av hver RNA prøve som behandles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. verifisering av RT-dPCR reaksjonen forhold med celle-linjer (valgfritt)
<ol><li>Bruk kommersielt tilgjengelig cellelinjer uttrykke ROS1 eller RET fusion for å kontrollere påvisning av fusion varianter mRNA rundt. Fortsett som følger:<ol>
<li>Homogenize flash-frosne celler i en guanidinium-baserte lysis løsning direkte fra frossen tilstand. Selv korte tining før homogenisering kan forårsake RNA fornedrelse og tap.</li>
		<li>Isolere RNA bruker silisium-membran spinn kolonner designet for RNA.</li>
		<li>Måle konsentrasjonen av RNA prøver ved en fluorometer med RNA-spesifikke reagenser og standarder.</li>
		<li>Fortynne isolert RNA i en bakgrunn av vill-type fra plasma eller en annen kommersiell kilde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utfør trinn fra reversere transkripsjon av RNA cDNA, Digital PCR, analyse og vurdering, og generasjon av resultatene vises i denne protokollen å bekrefte registrering av ønsket variant.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

H.M., L.J., K.A. og G.A.P. er ansatte i og holde aksjer i Biodesix, Inc. H.M., L.J. og G.A.P. er co-oppfinnere på en patentsøknad innlevert av Biodesix, som dekker en diagnostisk testsystem for deteksjon av sirkulerende genetisk varianter i ikke-småcellet lungekreft.

RET og ROS1 rearrangements utgjør sammen ~ 3% av driveren mutasjoner i NSCLC befolkningen18. Selv om sjeldne, er oppdagelsen av disse genetiske endringer avgjørende. NSCLC pasienter med disse endringene kan ha nytte av målrettet legemiddelselskap som hemmer spesifikt avvikende kinase aktiviteten som onco-protein13. Noen slik behandling er allerede godkjent av FDA for bruk i ROS1 positivt NSCLC, mens andre har vist seg for å være effektiv mot RET i kliniske studier19.
Digital PCR-teknologi gir følsomhet som er ideell for flytende biopsi programmer20. Det har vært betydelige adopsjon av denne teknologien for bruk med sirkulerende celle-gratis DNA for måling av svulst mutasjoner i pasienter med NSCLC,4,,6,,21,,22,,23 . I tillegg til cfDNA utviklet vi en protokoll som er utformet for robust måling av de mest utbredte fusion variantene hos pasienter med NSCLC sirkulere svulst RNA (figur 1A)10.
Vårt etablerte protokollen tillater for analytiske begrenser av oppdagelsen til 0,2% (figur 2). Mens RT-dPCR er svært bestemt og følsom, er analyser begrenset til panelet kjent fusion varianter som er valgt og multiplekset for gjenkjenning i PCR analysen. Dermed må fusjoner i multiplex analyser være nøye valgt å sikre riktig dekning i befolkningen i pasienter med NSCLC. Vi har med hell utviklet analyser for RET og ROS1 som samtidig gjenkjenner åtte fusion varianter resulterende fra rearrangements for RET eller ROS1 loci og dekke 99% og 88% av RET og ROS1 positive befolkningen, henholdsvis (figur 1ABC )17.
Siste test arbeidsflyten som beskrevet i denne studien omfatter satsvise kontroller for å sikre konsekvent resultater. Dette omfatter både en positiv analytiske standard samt to negative kontroller, som sammen sikrer det er ingen forurensning eller PCR hemming innenfor satsvise (Figur 3). For å sikre robusthet av analysen, var en studie utført ved hjelp av satsvis kontrollene over en 21-dagers periode (Figur 3D, H). Disse dataene viser konsistensen av RNA prosessen som er fastsatt i denne protokollen.
God laboratorium praksis og riktig RNA handling er sentrale komponenter som sikrer robust og nøyaktige resultater. Laboratoriet plass og utstyr dedikert til bruk med RNA, rensning utstyret etter hver bruk ved RNase-fri reagenser og forbruksvarer og bruke en RNase inaktivering spray på arbeidsområdet alle bidra til å redusere skadelige RNases. Samvittighetsfull håndtering av RNA prøver av teknikere, inkludert en dedikert labfrakk, hyppige hanske endringer, arbeider raskt gjennom RNA utvinning prosedyre, og holde prøvene på is er av største betydning å bevare eksempel integritet. Når RNA er omvendt transkribert å cDNA, er prøven i en mer stabil form som er mindre utsatt for degradering. I tillegg til praksis som støtter RNA integritet, bør PCR komponenter og eksempler opprettholdes i segregerte områder for å hindre kryss-kontaminering som kan føre til falske positive resultater. Lager PCR reagenser og utarbeidelse av PCR master mikser bør holdes atskilt fra PCR maler og stor forsiktighet bør tas å skille forsterket mal (post-PCR) fra alt pre forsterket materiale inkludert reagenser, RNA og cDNA prøver. Endelig er riktig generasjon og håndtering av emulgert PCR mikser før forsterkning sentral i å opprettholde slippverktøy integritet og optimal dPCR forhold. Forholdsregler som disse er kritiske under utføring av denne protokollen å få konsekvente og nøyaktige resultater. Alle data bør undersøkes av opplært personale før utgivelsen av resultater å forsikre at alle QC beregninger er oppfylt. Ved suboptimal resultater (Figur 4), bunken må revideres av teknisk personale og laboratoriet direktør og kan kreve re-behandlingen.
RT-dPCR resultater kan produseres så tidlig som 24 timer fra sample kvittering og 95% av prøven resultater innenfor testen sett brukt i denne studien (n = 984) ble rapportert til bestillende legen 72 timer fra tidspunktet for mottak (figur 5). Denne signalreturneringstid gir leger med mye nødvendig molekylære informasjonen i en tid der innvielsen av aktuelle terapi. Disse resultatene er vanligvis tilgjengelig tidligere enn de hentet ved hjelp av en konvensjonell vev biopsi. Ekstra biomarkers for NSCLC og andre kreftformer kunne utvikles med lignende sirkulerende RNA-baserte tilnærminger, og ville ha nytte av rask tid-å-Job. For eksempel kunne måling av programmert død Ligand 1 (PD-L1) mRNA transkripsjon bruker RT-dPCR informere leger om immunterapi alternativer. Det er også en voksende interesse nytten av flytende biopsi og dPCR overvåke for terapeutisk effekt. Tidligere indikasjoner på fremveksten av svulsten bruker genomisk testing for spesifikke varianter kan tillate leger justere behandlingsregimer før pasienter er symptomatisk av standarden på omsorg tiltak som imaging24. Protokoller som den rapporterte i denne studien er ideelt for overvåking på grunn av deres ikke-invasiveness, følsomhet, rask snu-tid og kostnadseffektivitet. Analysen beskrevet her gir resultater innen 72 timer fra sample kvittering, med minimal falske positive oppdagelsen ratene, som muliggjør rask behandling beslutninger og omgår noen begrensninger med vev-basert testing4.
Våre protokollen og dataene viser en robust testsystem for å identifisere lav overflod RNA varianter, samt potensialet for blod-baserte Mutasjon testing i klinisk praksis. For de pasientene som ikke har en praktisk driver tilnærminger mutasjon identifisert av rask målrettet flytende biopsi som dette, mer omfattende genomet og proteom testing fra både vev og blod kan gi enda større kliniske informasjon å støtte behandlingsplanlegging.

Opp til 25% av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) kan pasienter ikke ha tilstrekkelig vev tilgjengelig for testing på diagnosetidspunktet. Selv i tilfeller der vev er tilgjengelig, kan det ikke tilstrekkelig antall eller kvalitet utføre anbefales molekylær tester1,2. I tilfeller der det er nok vev fra en biopsi for molekylær profilering, pasienter må vente flere uker eller lenger resultater, eller begynne behandlingen uten molekylær resultater3,4. Imidlertid er det avgjørende at informativ molekylær diagnose være tilgjengelig gitt advent av flere målrettet behandling for pasienter diagnostisert med NSCLC. Testing av sirkulerende celle-gratis DNA (cfDNA) fra flytende biopsi er en løsning på utfordringene av tradisjonelle vev testing4,5,6. Gjeldende testing alternativer for praktisk mutasjoner i NSCLC med cfDNA og en lignende dPCR-basert arbeidsflyt for rask resultat generasjon, omfatter epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) sensitiverende mutasjoner ΔE746-A750 og L858R, EGFR motstand mutasjon T790M , KRAS Proto-Oncogene (KRAS) varianter, og B-Raf Proto-Oncogene (BRAF) variant V600E. Selv om ikke som bredt vedtatt av feltet, gir sirkulerende svulst-avledet budbringer RNA (mRNA) isolert fra flytende biopsi også viktig klinisk informasjon7,8,9. Vi har tidligere utviklet og rapportert på metoder for multiplex gjenkjenning av pigghuder Microtubule tilknyttet Protein som 4-anaplastisk Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase (EML4-ALK) fusion variantene fra blodplasma10. I denne studien utvidet vi disse metodene for å ta høyere orden multiplex RNA mål for ROS1 og RET, dekker åtte fusion varianter i hver analysen. Målet var å utvikle en rask, følsom, bestemt og reproduserbar metode for påvisning av disse fusion varianter fra plasma av pasienter tidligere diagnostisert med NSCLC.
Testprosessen startes i en lege kontor ved hjelp av RNA stabilisere blod samling rør11. Disse rørene inneholder en celle konserveringsmiddel og RNase hemmere. Prøvene er sendt prioritet over natten til sentralisert College av amerikanske patologer CAP-akkreditert/kliniske laboratoriet forbedring endringer (CLIA)-sertifisert laboratorium (Clinical Laboratory) for behandling av kompetent personell. Når mottatt av kliniske laboratoriet, gjennomføres hvert trinn i behandlingen under godkjent Standard operasjonsprosedyrer (SOP). Fullblod er centrifuged gjenopprette plasma, som deretter brukes til å isolere sirkulerende RNA som enten gratis blod eller i ESP moieties, for eksempel exosomes og blodplater7,8,9. For å isolere RNA fra seksjonene, valgte vi systemet for RNA utvinning basert på sammenligninger av flere utvinning metoder. Den isolerte RNA er konsentrert og omvendt transkribert til cDNA. Flere revers transkriptase enzym og gen-spesifikke primere ble evaluert under optimalisering av metoden cDNA syntese å maksimere ROS1 og RET målet transkripsjon konvertering10. Dette er avgjørende for lav overflod sirkulerende transkripsjoner, som tumor-avledet fusion varianter. Til slutt, vi optimalisert dPCR primer og sonde konsentrasjoner å tillate multiplex påvisning av RET eller ROS1 fusion varianter og kontroll genet, glucuronidase-β (GUSB). Vi da kombinert de beste forholdene fra hver av optimalisering studiene til en endelig låst protokoll før du utfører analytisk validering studiene beskrevet i denne rapporten. Denne protokollen og disse resultatene gir grunnlaget for en raskere og følsom arbeidsflyt for rutinemessig påvisning av sjelden sammensmelting varianter i sirkulasjon.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

Vi har utviklet nye metoder for isolering og karakterisering av svulst-avledet sirkulerende ribonukleinsyre (cRNA) for blod-baserte flytende biopsi. Robust oppdaging av cRNA utvinnes fra blod representerer en løsning på et kritisk udekkede behov i klinisk diagnostikk. Testen starter med samling av fullblod i blod samling rør som inneholder konserveringsmidler som stabiliserer cRNA. Celle-fri, exosomal og blodplater-assosiert RNA er isolert fra plasma i denne testsystemet. CRNA er omvendt transkribert komplementære DNA (cDNA) og forsterket med digital polymerasekjedereaksjons (dPCR). Prøver evalueres for både målet biomarkør samt et kontroll-gen. Test validering inkludert grensen for deteksjon, nøyaktighet og robusthet studier med analytiske prøver. Metoden utviklet på grunnlag av disse studiene reproduserbar oppdage flere fusion varianter for ROS1 (C-Ros proto-oncogene 1, 8 varianter) og RET (omorganisert under hva proto-oncogene; 8 varianter). Eksempel behandling arbeidsflyten er optimalisert slik at testresultatene kan konsekvent genereres innen 72 timer etter sample kvittering.

Denne protokollen beskriver en test utviklet for påvisning av RNA fusion varianter for bruk i måling av driveren mutasjoner i plasma NSCLC pasienter (figur 1A). Fusion mRNA produkter fra uttrykk for de vanligste RET og ROS1 rearrangements i befolkningen NSCLC ble identifisert13,14,15,16,17. Multiplex PCR analyser ble deretter utviklet for å oppdage de åtte vanligste transkripsjon variantene for hvert mål i NSCLC i en enkelt reaksjon. De vanligste translocations på ROS1 locus generere foreninger med 5 deler av CD74, SDC4, SLC34A2, EZR eller TPM3 gener (figur 1B). De vanligste translocations på RET locus føre til sammenstillingen med KIF5B, som analysen omfatter seks ekson veikryss. Ekstra RET partnere som dekkes inkluderer dem med CCDC6 og TRIM33 (figur 1C). Totalt på analyser dekker ca 88% av ROS1 og 99% av RET endringer oppstå i NSCLC pasientgruppen17.
Spesifisiteten av analysen komponentene ble først evaluert med åtte individuelle i vitro RNAs som inneholder mRNA sekvensen for fusion transkripsjoner dekket av ROS1 eller RET multiplekset analyser. Hver RNA Art ble testet mot hver individuelle variant analysen som omfatter multiplex versjonen. Det var ingen kryssreaktivitet av disse analyser, dermed demonstrere 100% analytiske spesifisitet innenfor den designet multiplekset analyser (data ikke vist). For å fastslå den laveste grensen for påvisning av test-protokollen, totalt RNA avledet fra cellelinjer uttrykke en fusion variant inkludert i analysen ble blandet i en bakgrunn av normal på 5%, 1%, 0,2% og 0,04% konsentrasjoner. De multiplex RET og ROS1 variant PCR analyser oppdaget så lite som 0,2% fusion variant (figur 2A-B). I tillegg en forberedelse på 5% off-målet cellen linje avledede RNA (uttrykke en EML4-ALK fusion transkripsjon) ikke ble oppdaget med de multiplex ROS1 og RET analyser, ytterligere å demonstrere spesifisitet (figur 2A-B).
Precision testing av RT-dPCR ble utført for både ROS1 og pensjonert analytiske kontroll materialet består av ekvimolare i vitro RNAs behandles i tre konsentrasjoner (høy, middels og lav) med omvendt transkripsjon og dPCR på tre ulike anledninger på samme dag (intra-dag), på tre dager (mellom dag), og med to operatører (mellom operatør). Resultater fra presisjon testing vist nøyaktig påvisning av både fusion transkripsjon av interesse, samt en kontroll genet, GUSB, som en intern QC beregning (figur 2C-D).
I tillegg til GUSB interne kontrollen, ble hvert parti av klinisk prøver kjørt med et sett med satsvise kontroller. En positiv kontroll ble utviklet av en blanding av analytiske i vitro RNA som representerte hver av fusion variantene testet i RT-dPCR, samt analytisk i vitro RNA for GUSB. Denne RNA ble tilsatt i normal humant plasma lysate under RNA utvinning og ble behandlet sammen med klinisk prøvene i protokollen. Ingen revers transkriptase (ingen RT) kontrollen var en negativ kontroll å bekrefte fravær av forurensende stoff i RNA utvinning arbeidsflyten og demonstrere spesifisitet primerne for RNA. Ingen RT kontrollen ble generert med samme materiale som positive kontrollen, men den inneholder ikke enzymet i cDNA syntese reaksjonen. Den ingen RNA kontrollen (NRC) er en negativ kontroll å bekrefte fravær av forurensende utskrifter i omvendt transkripsjon reaksjon komponenter. Denne kontrollen ble introdusert i arbeidsflyten ved cDNA syntese trinn, og vann ble lagt i reaksjonen i stedet for en RNA mal. Ingen RT og NRC kontrollene må være negativt i begge kanaler, hvis nøyaktige resultater leveres. Tabell 1 viser omvendt transkripsjon reaksjon komponentene for hver kontroll. Eksempler på 2D tomter for hver av disse kontrollene vises for ROS1 (Figur 3 Vekselstrøm) og RET (Figur 3 E-G) multiplex analyser. Fusion varianter ble oppdaget ved hjelp av en fluorescein amidite (FAM) sonde og representeres langs y-aksen, mens kontroll genet, GUSB, ble oppdaget ved hjelp av en 5-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX) sonde på x-aksen. Disse satsvise kontrollene ble vurdert i løpet av 21 dager til bestemme analysen robusthet. Fusion positiv dråper og GUSB kontroll genet dråper ble observert for ROS1 og RET i alle 21 kjører utført i løpet av studien (Figur 3D, H). Alle negative kontroller (ingen RT og NRC) gitt negative resultater over hele 21 dager (data ikke vist).
Muligheten til å feilsøke er en kritisk komponent i enhver testprotokollen kjøres i innstillingen kliniske laboratoriet. Her gir vi reelle eksempler på sub-optimale resultater ved hjelp av RT-dPCR-protokollen. Først er en eksempel 2D plot demonstrere viktigheten av ingen revers transkriptase kontrollen (Figur 4A). I dette eksemplet fantes mutant positiv dråper selv om det var ingen cDNA konvertering skyldes mangel på enzymet. Dette resultatet var sannsynlig på grunn av dPCR primere forsterke off-målet genomisk DNA. I dette tilfellet vil design av intron-spenner analysen hindre forsterkning av genomisk DNA. Eventuelt et RNase uten DNase enzym kan brukes til å eliminere skadelige DNA, men dette anbefales ikke for gjenkjenning av sjeldne mål som dårligere RNA kan oppstå under inkubasjonen med enzymet. Neste eksempel 2D handlingen var en NRC med positiv dråper i begge kanaler (Figur 4B). Dette indikerte forurensning på et tidspunkt i oppsettet av RT-dPCR. I dette tilfellet er anbefaling å forkaste potensielt kontaminerte reagenser i testing, grundig decontaminate alt utstyr og re-teste med fersk reaksjon komponenter. Det tredje eksempel 2D plott presentert som spray til dråper langs en 45° (Figur 4C). Dette forårsakes ofte av skjæring og coalescing til dråper. Forsiktig dråpe håndtering før termisk sykling er viktig, som dråper er utsatt for skade. Vi anbefaler bruk av automatiserte slippverktøy generasjon, når tilgjengelig. Hvis overføring manuelt generert dråper, være sikker på å velge anbefalte wide-fødte tips og ansette forsiktig pipettering teknikk. Dråpeoverføring krever langsom aspirasjon og dispensing, med hver foregår over 5-6 sekunder, og det er viktig at pipette tips åpningen ikke touch slippverktøy kassetten eller godt. Når dispensing, holde pipette spissen på væske nivå og heve den sakte som dråper er utlevert (se video for demonstrasjon). Siste 2D tomten eksemplet demonstrerer en mangel på avstanden mellom positive og negative slippverktøy befolkningen (Figur 4 d). Dette kan ha flere årsaker. Sterk PCR inhibitors, som vaskemidler brukes i lyse buffere og et overskudd av svært degradert DNA, kan føre til tap av separasjon. I dette tilfellet bør du vurdere å legge til litt finpuss mellom cDNA syntese og dPCR (som beskrevet i trinn 5 i denne protokollen). Til slutt, mangel på separasjon kan også ha sub optimal forsterkning forhold, og optimalisering av PCR-trinn bør også vurderes.
Dataene i figur 5 representerer 984 reelle pasient smak snu-tid og demonstrerer rask natur test arbeidsflyten. Resultatene ble rapportert til den behandlende legen så tidlig som innen 48 timer (79% av tilfellene) sample kvittering og i 95% av tilfellene, innen 72 timer. I konklusjonen, kan bruk av stabilisert sirkulerende RNA blod samling rør, optimalisert RNA utvinning prosedyrer fra blod og RT-dPCR kjøres i en optimalisert protokoll med de riktige interne og satsvis kontroller, gi en rask testsystem for nøyaktig påvisning av fusion RNA varianter relevant i NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Figur 1 : Oversikt over blod prøve behandling trinnene for Fusion Variant oppdagelsen bruke analyser spesifikk for mest utbredt RET og ROS1 varianter i NSCLC. (A) eksempelannonsene testing startes når fullblod tegnes og en BCT leveres i prøven samling kit til kliniske laboratoriet. Sirkulerende RNA gjenvinnes fra flere kilder i blodplater-beriket plasma, omvendt transkribert med gene bestemt grunning og renset for bruk i dPCR. Eksempler er behandlet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig system som består av slippverktøy generasjon (emulsjon), forsterkning og dråpe teller. Dataene er analysert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Testresultatene deretter dokumenteres og rapporteres tilbake til test-ber legen. Prosessen er utformet for å arbeide innenfor en tidsramme på 72 timer fra sample kvittering resultatet utgivelse. Åtte varianter (B) ROS1 og (C) RET dekkes i de multiplex analyser. Tilpasset fra Biodesix nettsted med tillatelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Figur 2 : Analytisk validering. Celle-linjer uttrykke (A) SDC4-ROS1 fusion og (B) CCDC6-RET fusion var fortynnet i en bakgrunn av totale menneskelige vill-type RNA (WT RNA). Hver fusion-varianten, ble grensen for påvisning etablert på 0,2% variant frekvens med forhåndsdefinerte vilkår for hver variant analysen. Alle prøver over denne grenseverdien inneholdt også minst 21 kopier av kontroll genet. 5% EML4-ALK (ALK) standard i en bakgrunn av vill-type ble testet for å demonstrere analysen spesifisitet, som ble bekreftet av et negativt resultat. Analytiske multiplex RNA standarder ble målt på høy, medium og lave konsentrasjoner (C) ROS1 og (D) pensjonert presisjon ble evaluert over tre kjører samme dag (Intra-dag), tre kjører på tre dager (mellom dag), og med to uavhengige aktører (mellom operatør). Av antall kopier og standardavvik vises. Tilpasset fra Biodesix nettsted med tillatelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Figur 3 : Batch prosessering kontroll eksemplene og robusthet Data. 2D tomt ROS1 multiplekset analysen dPCR resultater for (A) positive kontroll, (B) ingen revers transkriptase kontroll, og (C) ingen RNA mal kontroll. (D) kontroller ble kjørt på 21 dager (unntatt helger og helligdager). Mener kopi antallet +/-standardavvik for ROS1 positive kontroll ble 439 +/-141. Ingen revers transkriptase og ingen mal kontroller var også kjøre på hver dag, og disse var alle negative (data ikke vist). 2D tomt RET multiplekset analysen dPCR resultater for (E) positive kontroll, (F) ingen revers transkriptase kontroll og (G) ingen RNA mal kontroll. (H) kontroller ble kjørt på 21 dager (unntatt helger og helligdager). Mener Kopier +/-standardavvik for RET positiv kontroll ble 586 +/-182. Ikke vist er ingen revers transkriptase og ingen mal-kontroller som ble også kjøre på hver dag og var alle negative. Tilpasset fra Biodesix nettsted med tillatelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Figur 4 : Feilsøking RT-dPCR. 2D tomter representerer sub-optimale dPCR resultatene som oppnås når det er (A) forurensning ingen revers transkriptase kontroll, (B) forurensning ingen RNA kontroll, (C) skjæring og coalescing dråper og (D ) dårlig optimalisert PCR betingelser eller PCR hemming. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Figur 5 : Behandlingstid (TAT). TAT (i timer) ble kompilert for tester ber om en RNA variant (n = 984). Data utelukker helger, ferier og prøver holdt > 24 timer på grunn av ufullstendige klinisk informasjon på laboratorium Test skjemaer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tabell 1: Forberedelse omvendt transkripsjon reagenser til prosessen kontroller.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volum</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix for sonder (ingen 2-deoxyuridine 5'-trifosfat)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x variant målet primere/sonder satt (450 nmol/L primere, 250 nmol/L FAM sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x målet primere/sonde kontrollsett (450 nmol/L primere, 250 nmol/L HEX sonde)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>nuclease-fritt vann</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Utarbeidelsen av master mix for dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sykling trinn</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
			<td># Sykluser</td>
			<td>Rampen Rate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym aktivisering</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rødsprit</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avspenning/extension</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym deaktivering</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hold (valgfritt)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>uendelig</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Sykling varmeforhold.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-basert Test for påvisning av ROS1 og RET Fusion transkripsjoner sirkulere ribonukleinsyre bruker Digital polymerasekjedereaksjons

Oppdagelsen av sirkulerende ribonukleinsyre (cRNA) fra blod er et udekket behov i klinisk diagnostikk. Her beskriver vi metoder som karakteriserer cRNA fra ikke-småcellet lungekreft pasienter med følsom og spesifikke digitale polymerasekjedereaksjons. Testene kravene design å merker fusion varianter innen 72 timer.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Bruke Hele Spytt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Overvåking

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Vurderingen av magetømmingen i ikke-overvektige diabetikere mus Bruke en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-oktansyre Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolasjon og forplantning av sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Romanen diagnostikk i revisjon kirurgi: implantat Sonication og Multiplex polymerasekjedereaksjons

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smak eksamen: En kort og validert Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Digital PCR for kvantifisering sirkulerer MicroRNAs i akutt hjerteinfarkt og hjerte-og karsykdommer

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

Tradisjonell Trail Making test modifisert til Brand-ny vurdering verktøy: Digital og Walking Trail Making test

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...