Name: a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Vi tackar våra samarbetspartners, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr Dianna Maar och Dr Samantha Cooper från Digital Biology Center (Bio-Rad Inc. CA) för deras assay design stöd; Nezar Rghei och Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Kanada) för kritiska råd när du optimerar RNA extraktion protokollet. och Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello och Joellyn Enos för hjälp med testa krav och kommersiella övervakning.

Tillverkarnas instruktioner följs för reagenser som anges nedan, om inte annat beskrivs. De PCR-analyserna finns kommersiellt tillgängliga produkter utformade för att upptäcka ROS1 och RET fusioner.
1. arbeta med RNA som förberedelse för omvänd Transkription (RT)-dPCR: laboratorium metodtips
<ol><li>Skapa ett RNase-fri miljö när du arbetar med RNA.<ol>
<li>Använda kommersiellt tillgängliga sprayer för att inaktivera kontaminerande RNaser.</li>
		<li>Använd certifierade RNase-gratis reagenser, tips och rör. Använd barriär tips för pipetter för att förhindra införandet av RNaser eller korskontaminering av prover.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd alltid laboratorierock för att förhindra att partiklar faller från kläder i ditt urval. Utse en lab coat specifik använda med RNA bearbetning.</li>
	<li>Använd handskar för att förhindra kontaminering av prov från RNaser i huden. Byt handskar ofta. Obs: Anta laboratorium ytor är förorenat med RNase eftersom de utsätts för miljön. Handskar som kontakta hud, hår, dörrhandtag, frys handtag, pennor/markörer, etc. antas inte längre vara RNase-fri.</li>
	<li>Sanera pipetter, bänkskivor, centrifuger och andra arbetsytor med en RNase inaktivering spray före användning.</li>
	<li>Om möjligt, bibehålla en uppsättning av utrustning endast för användning med RNA.</li>
	<li>Minimera störningar av luftflödet i lab områden när du arbetar med RNA-prover för att förhindra att partiklar från falla i prover eller kontaminerande arbetsområdet.</li>
	<li>Store renat RNA vid-80 ˚C.</li>
	<li>Undvik flera frysa-töar av RNA-prover, eftersom detta kan orsaka nedbrytning.</li>
</ol>2. generering av Analytic RNA Material för de positiva kontrollerna
<ol><li>Designa syntetiska DNA med publicerade mRNA sekvenser för fusion varianter av intresse10.<ol>
<li>För en given fusion variant, Välj en sekvens av mRNA-fusion som innehåller de fusion webbplats plus tillräcklig längd flankerande på varje sida att täcka den PCR-Amplikonen.</li>
		<li>Välj nukleotidsekvenser mellan 50-250 nt att efterlikna storleken av cirkulerande RNA tagits med trombocyt-berikad plasma.</li>
		<li>Lägga till en T7 promotorn sekvens (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') till 5' slutet av sekvensen mål.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beställa syntetiska sekvenser som dubbel strandsatta deoxiribonukleinsyra (DNA) fragment.</li>
	<li>Beredes syntetiskt DNA i Tris-EDTA (TE) bufferten till en slutlig koncentration på 10 ng/µL.</li>
	<li>Konvertera 60 ng syntetiskt DNA till RNA med hjälp av in vitro- transkription.</li>
	<li>Rena RNA avskrifter med fenol/guanidin-baserade reagens12.<ol>
<li>Inkluderar DNAS I, RNase-fri att ta bort kvarvarande mall DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mäter koncentration av renat in vitro- RNA med en kommersiellt tillgänglig fluorometer med RNA-specifika färgämnen och standarder. Säkerställa RNA är inom intervallet som är godtagbart för den valda standarden. Utspädning kan krävas.</li>
	<li>Bekräfta lyckad transkription med gelelektrofores använder en 2% agarosgel blandat med RNA gel fläcken och en hög räckvidd RNA stege inklusive 50-250 nt storleksintervall.<ol>
<li>Last 500 ng av varje in vitro- RNA på en gel.</li>
		<li>Kör gelen vid 5 V/cm.</li>
		<li>Visualisera enda band med belysning, och dokumentera resultaten.</li>
		<li>Bekräfta förväntade avskrift storlek för alla fusion varianter (baserat på design i steg 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekräfta detektion av varje in vitro- RNA av RT-dPCR med matchade variant-specifika PCR-analys (se steg 5-8 i protokollet).</li>
	<li>Tillval: Förbereda en equimolar blandning av in vitro- RNA som innehåller alla varianter av fusion och kontroll genen GUSB.</li>
	<li>Om steg 2,9 utförs: bekräfta upptäckt av alla fusion varianter ingår i kontroll blandningen av dPCR använder variant-specifika PCR-analyser (se steg 5-8 i detta protokoll).</li>
	<li>Bestämma önskad ingång koncentration för analytic positiva kontroller genom att testa koncentrationer från 0,25 till 2,5 fg10. Välj koncentrationen baserat på önskat nummer kopiorna.</li>
	<li>Efter bekräftelse, att förbereda 10 µL engångsbruk alikvoter av analytic RNA för användning i positiv kontroll (steg 4,4) och store vid-80 ˚C.</li>
</ol>3. givare exemplar
<ol><li>Samla 10 mL humant helblod prover i 10 mL blod insamling rör (BCT) som innehåller cellfria RNA konserveringsmedel. Obs: Alla mänskliga givare skall samtycke till forskning användning och ingen givare-specifika identifierande information skall samlas in eller används vid provning.</li>
	<li>Bearbeta hela blodprov inom den tidsram som angetts av BCT tillverkaren.</li>
	<li>Poolade normal humanplasma kan köpas från en kommersiell källa för användning inom den analytiska positiv kontrollen. Förbereda för engångsbruk, 1 mL alikvoter av poolade normal humanplasma och förvaras vid-80 ° c för användning med den positiva kontrollen (steg 4.4).</li>
</ol>4. återvinning av cirkulerande RNA från Plasma
Obs: Det är viktigt att arbeta snabbt under denna procedur.
<ol><li>Centrifugera helblod rör vid 200 x g i 20 min.</li>
	<li>Samla upp till 4 mL plasma från centrifugeras bloduppsamlingsrör med serologiska pipett. Var noga med att inte störa eller aspirera lättcellsskikt lagret.</li>
	<li>Isolera cirkulerande RNA med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kit som kan fånga exosomes, trombocyter och cellfria RNA från plasma. Isolera RNA från positivt kontrollprov tillsammans med varje batch.</li>
	<li>
Förbered den positiva kontrollen för varje parti av kliniska prover enligt följande:
	<ol>
<li>Tina 1 mL poolade normal humanplasma alikvotens (steg 3.3).</li>
		<li>Tina 10 µL analytic RNA alikvot (steg 2,12).</li>
		<li>Förbereda positiv kontroll genom att lägga 10 µL analytic RNA i normal humanplasma provet när etanol har lagts till plasma lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluera prover med 100 µL nuclease-gratis vatten. Omedelbart gå vidare med RNA städa upp och koncentration.<ol>
<li>Prover kan lagras på våt is, och omfattas, för upp till en timme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koncentrera sig RNA kolumnbaserade metoden och eluera i 9 µL RNase-gratis vatten.<ol>
<li>Omedelbart gå vidare till steg 5, eller hålla prover på våt is för upp till en timme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. omvänd Transkription av RNA till cDNA
<ol><li>Konvertera koncentrerad cirkulerande RNA-prov till cDNA med en kommersiellt tillgänglig omvänd Transkription reaktion kit inklusive slumpmässig primers (se tabell 1 för komponenter). Obs: Gen specifika primers är valfria och kan utformas för test varianter. Grundfärger är utformade utifrån målet RNA-sekvens. Använda fusion variant sekvenser från steg 2.1.<ol>
<li>Inkluderar ingen omvänt transkriptas kontrollprov och inga RNA kontrollprov (se tabell 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolera cDNA från omvänd Transkription reaktion använder en kommersiellt tillgänglig DNA koncentrator spin kolumn. Obs: Detta steg underlättar borttagning av enzymer, primers och gratis deoxynucleotide trifosfater (dNTP).</li>
	<li>Använd cDNA omedelbart i PCR-reaktioner eller förvara vid-80 ˚C.</li>
</ol>6. digital PCR
Obs: Denna PCR är specifika för droplet digital PCR (se Tabell för material).
<ol><li>
PCR-mix försiktighetsåtgärder.
	<ol>
<li>Använd en disponibel lab kappa och nitril handskar.</li>
		<li>Använd PCR blanda reagenserna i en dedikerad reagens område. Hantera inte cDNA i området endast reagens-beredning.</li>
		<li>Täcka sonder samtidigt arbetar för att skydda dem från ljus. Överdriven ljus kan foto bleker den fluorescerande färgämne knutna till sonden.</li>
		<li>Transport mixar, omfattas och skyddas från ljus, in i ett separat före förstärkning område innan cDNA är att läggas.</li>
		<li>Lägg till cDNA testas till PCR-mix i en PCR-ren huva beläget i före förstärkning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered PCR mixar för en sista reaktionsvolym av 20 µL enligt tabell 2.</li>
	<li>Distribuera PCR mixar + cDNA till PCR-plattor. Obs: Användning av en tallrik-layout som en guide rekommenderas.</li>
	<li>Täck plåten med en avtagbar platta sealer.</li>
	<li>Centrifugera plattor kort för att samla in prover på botten av brunnarna.</li>
	<li>Mixen på plattan shaker på en låg inställning för 10 s.</li>
	<li>Centrifugera plattor kort för att samla in prov på botten av brunnen.</li>
	<li>Ta bort plattan sealer. Utföra droplet generation för PCR-cDNA mix med antingen en manuell eller automatiserad droplet generationens system.<ol>
<li>För manuell droplet generation, överföra 20 µL PCR-mix till exempel brunnar på droplet generation kassetten. Tillsätt 70 µL av droplet generation olja. Täck med gummi packning och överföring patron till manuell droplet generator att inleda droplet generation. Efter droplet generation, överföra droppar till en färsk PCR-plattan med hjälp av tips som rekommenderas av tillverkaren. Aspirera och dosera droppar långsamt, över 5 till 6 s varje, utan att röra vid öppnandet av spetsen på droplet patron eller platta.</li>
		<li>För automatiserad droplet generation, täta plattan med en folie tätning och överföring till droplet generatorn. Säkerställa alla tips, patroner, och plattorna är på plats innan du börjar droplet generation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Följande droplet generation och överföring av droppar till en färsk PCR-plattan, försegla med en folie plattan sealer och termisk cykel plattor med inställningarna i tabell 3.</li>
	<li>Efter termocykel är kör komplett, Läs plattan med en droplet läsare. Skapa en skylt layout för läsaren mjukvaran som identifierar platsen för kontroller, prover, etc., och belastning i programvara för att börja läsa.</li>
</ol>7. analys och granskning, och Generation av resultat
<ol><li>Analysera plattan läsa resultat med hjälp av kommersiellt tillgängliga program.</li>
	<li>Navigera till menyn analysera att Visa tvådimensionell (2D) amplitud tomter.</li>
	<li>Utvärdera den övergripande kvaliteten på data genom att undersöka droplet data.<ol>
<li>Utvärdera data för total accepterade event nummer använda menyn händelser. Om det finns färre än 10 000 händelser per brunn, noggrant utvärdera data för ytterligare problem.</li>
		<li>Kontrollera data för avvikande fluorescens amplituder. Betydande amplitud skillnader och koncentration skillnader mellan identiska prover tyder på dålig hantering eller blandning av prover.</li>
		<li>Göra anteckningar av droplet kluster med spraymönster på en 45-graders axel, vilket är ett tecken på dålig kvalitet droppar eller problematiska prover.</li>
		<li>Först undersöka positiv kontroll, nr omvänt transkriptas (nr RT) och nr RNA kontroll (NRC) data. Välj alla kontrollprover och undersöka kluster kvalitet genom 2D tomt. För korrekt tröskelvärde, bör en tydlig åtskillnad mellan droplet kluster vara uppenbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För varje test variant, ange tröskelvärde utifrån kontrollbrunnarna.<ol>
<li>Ange tröskelvärden på 2D tomter med verktyget hårkorset till separata dubbel negativ droplet befolkningen från kontroll gen befolkningen (märkt med 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite sond), y-axeln och variant genen befolkningen, om presentera) märkt med fluorescein amidite OR 6-carboxyfluorescein probe), x-axeln.</li>
		<li>Summan kopior från varje replikera brunn för ett enda prov.</li>
		<li>Express testresultat som antalet variant kopior upptäcks. Obs: Att fastställa analytic cutoff värdet för att ringa ett positivt eller negativt prov, köra en normal frisk donator prov ställa (minst 10 enskilda prov) genom slutförda processen och upprätta cutoff ovan någon detekterbar bakgrund signal för mutationen av intresse. Dessutom fastställa antalet gene kontrollexemplar krävs att kalla ett positivt eller negativt resultat. Denna kontroll gen cut-off fungerar som en intern kvalitetskontroll (QC) att utvärdera kvantitet och kvalitet av varje RNA-prov som bearbetas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. verifiering av RT-dPCR reaktion villkor med hjälp av Cell-linjer (tillval)
<ol><li>Kontrollera identifiering av fusion varianter, använda kommersiellt tillgängliga cell-linjer uttrycker ROS1 eller RET fusion mRNA av intresse. Gör så här:<ol>
<li>Homogenisera flash-frysta celler i en guanidinium-baserade lysis lösning direkt från fryst tillstånd. Även kort upptining före homogenisering kan orsaka RNA försämringen och förlusten.</li>
		<li>Isolera RNA hjälp kiseldioxid-membran spin kolumner för RNA.</li>
		<li>Mätning av koncentrationen av RNA-prover med en fluorometer med RNA-specifika reagens och standarder.</li>
		<li>Späd isolerade RNA i en bakgrund med vildtyp RNA från plasma eller en annan kommersiell källa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utför steg från omvänd Transkription av RNA till cDNA, Digital PCR, och dataanalys och granskning, och Generation av resultat som anges i detta protokoll för att bekräfta identifieringen av önskad variant.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

H.M., L.J., K.A. och G.A.P. är anställda av och innehar aktier i Biodesix, Inc. H.M., L.J. och G.A.P. är samtidig uppfinnare på en patentansökan som lämnats in av Biodesix, som täcker ett diagnostiskt testsystem för detektion av cirkulerande genetiska varianter i icke-småcellig lungcancer.

RET och ROS1 rearrangements utgör tillsammans ~ 3% av de driver mutationerna inom NSCLC befolkningen18. Även sällsynta, är påvisande av dessa genetiska förändringar avgörande. NSCLC patienter med dessa förändringar kan dra nytta av riktade therapeutics som specifikt hämmar aktiviteten avvikande tyrosinkinashämmare som resulterar från den onco-protein13. Några sådana behandlingar är redan godkända av FDA för användning i ROS1 positiv NSCLC, medan andra har visat sig vara effektiva mot RET i kliniska prövningar19.
Digital PCR teknik ger känslighet som är idealisk för flytande biopsi program20. Det har förekommit betydande antagandet av denna teknologi för användning med cirkulerande cellfria DNA för mätning av tumör mutationer hos patienter med NSCLC4,6,21,22,23 . Förutom cfDNA utvecklade vi ett protokoll som utformats för robust mätning av de vanligaste fusion varianterna hos patienter med NSCLC från cirkulerande tumör RNA (figur 1A)10.
Våra etablerade protokollet möjliggör analytic gränsen för upptäckt ner till 0,2% (figur 2). Medan den RT-dPCR är exceptionellt specifika och känsliga, begränsas analyserna till panelen av kända fusion varianter som väljs och multiplexed för detektering i PCR-analysen. Således, fusioner ska ingå i multiplexade analyser måste väljas noggrant att säkerställa ordentlig täckning inom populationen av patienter med NSCLC. Vi har framgångsrikt utformat analyser för RET och ROS1 som samtidigt upptäcka åtta fusion varianter resultanten från rearrangements de RET eller ROS1 loci och täcka 99% och 88% av RET och ROS1 positiva befolkningen, respektive (figur 1B-C )17.
Sista testet arbetsflödet som beskrivs i denna studie innehåller batch kontroller för att säkerställa konsekvens av resultat. Dessa kontroller inkluderar både en positiv analytic standard samt två negativa kontroller, som tillsammans garanterar ingen förorening eller PCR hämning som inträffar inom partiet (figur 3). För att säkerställa robustheten i analysen, utfördes en studie med hjälp av batch-kontrollerna under en 21-dagarsperiod (figur 3D, H). Dessa data visar konsekvens av RNA processen som fastställs i detta protokoll.
God laboratoriesed och lämplig RNA hantering är viktiga komponenter för att säkerställa robust och korrekta resultat. Laboratorium och utrustning dedikerad att använda med RNA, rengöring av utrustning efter varje användning, använder RNase-fri reagenser och förnödenheter och tillämpa ett RNase inaktivering spray på den arbetsplats som alla bidrar till att minska kontaminerande RNaser. Samvetsgrann provhantering RNA av tekniker, inklusive en dedikerad labbrock, ofta handske förändringar, arbetar snabbt genom förfarandet för RNA-extraktion, och hålla prover på is är av yttersta vikt att bevara provet. När RNA har omvänd transkriberas till cDNA, är provet i en mer stabil form som är mindre benägna att nedbrytning. Förutom metoder som stöder RNA integritet, bör PCR-komponenter och prover bibehållas i segregerade områden för att förhindra korskontaminering som kan leda till falskt positiva resultat. Beståndet PCR reagens och beredning av PCR-master mixar bör hållas åtskild från PCR-mallar och stor försiktighet bör iakttas att segregera förstärkta mall (post-PCR) från alla pre förstärkta material inklusive reagenser, RNA och cDNA prover. Slutligen, ordentlig generering och hantering av emulgerade PCR mixar innan förstärkning är centralt för att upprätthålla droplet integritet och optimal dPCR villkor. Försiktighetsåtgärder som dessa är kritiska under genomförandet av detta protokoll att få konsekventa och korrekta resultat. Alla data bör undersökas av utbildad personal innan lanseringen av resultat för att vara säker att alla QC mätvärden har uppfyllts. När det gäller suboptimala resultat (figur 4), batchen måste granskas av teknisk personal och laboratoriet direktör och kan kräva vidareförädling.
RT-dPCR resultat kan produceras så tidigt som 24 timmar från provet kvitto och 95% av provets resultat inom testet som används i denna studie (n = 984) rapporterades för beställning läkaren i mindre än 72 timmar från tidpunkten för mottagandet (figur 5). Detta turn-around tid ger läkare med mycket behövde molekylär information inom en tidsram som gör initiering av lämplig behandling. Dessa resultat är vanligtvis tillgängliga tidigare än de som uppnås med hjälp av en konventionell vävnad biopsi. Ytterligare biomarkörer för NSCLC och andra cancerformer kan utvecklas med hjälp av liknande cirkulerande RNA-baserade metoder och skulle dra nytta av samma snabba tid-till-resultat. Mätning av programmerad död Ligand 1 (PD-L1) mRNA avskriften med RT-dPCR skulle exempelvis kunna informera läkare om immunterapi alternativ. Det finns också ett växande intresse för nyttan av flytande biopsi och dPCR i övervakning för terapeutisk effekt. Tidigare indikationer på återuppvaknande av tumören med hjälp av genomiska tester för vissa varianter kan möjliggöra läkare justera behandlingsregimer innan patienter är symtomatisk av standard av Omvårdnadsåtgärder såsom imaging24. Protokoll som den som rapporterats i denna studie är idealisk för övervakning på grund av deras icke-invasivt, känslighet, snabb turn-around tid och kostnadseffektivitet. Analysen beskrivs häri ger resultat inom 72 timmar från provet mottagandet, med minimal upptäcktstakt i falskt positivt, vilket underlättar snabb behandlingsbeslut och kringgår vissa begränsningar som upplevt med tissue-baserade tester4.
Våra protokoll och data visar ett robust testsystem för att identifiera låga överflöd RNA varianter samt risken för blod-baserade mutation testning i klinisk praxis. För de patienter som inte har en angripbara drivrutin mutation identifieras av snabba riktade flytande biopsi närmar sig som denna, tillsats av mer omfattande genomet och proteomet testning från både vävnad och blod kan ge ännu bredare klinisk information att stödja dosplanering.

Upp till 25% av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) kan patienter inte ha tillräcklig vävnad tillgänglig för testning vid tidpunkten för diagnos. Även i fall där det finns vävnad, kan det inte i tillräcklig kvantitet eller kvalitet att utföra rekommenderas molekylära tester1,2. I fall där det finns tillräckligt vävnad från en biopsi för molekylär profilering, patienter kan ha att vänta flera veckor eller längre resultat eller påbörja behandling utan molekylära resultaten3,4. Det är dock avgörande att informativa molekylär diagnos finnas med tanke på tillkomsten av flera riktade behandlingsalternativ för patienter med NSCLC. Provning av cirkulerande cellfria DNA (cfDNA) från flytande biopsi är en lösning på utmaningarna som traditionella vävnad testning4,5,6. Aktuella tester alternativ för angripbara mutationer i NSCLC med cfDNA och en liknande dPCR-baserat arbetsflöde för snabba resultat generation, inkluderar de epidermal tillväxtfaktor (EGFR) sensibiliserande mutationer ΔE746-A750 och L858R, EGFR motstånd mutation T790M , KRAS proto-onkogener (KRAS) varianter och B-Raf proto-onkogener (BRAF) variant V600E. Även om inte så brett antagna av fältet, kan cirkulerande tumör-derived budbärar-RNA (mRNA) isolerade från flytande biopsi också ge viktig klinisk information7,8,9. Vi har tidigare utvecklat och rapporterade om metoder för multiplexering upptäckt tagghudingar mikrotubulära associerade Protein som 4-anaplastiskt lymfom Receptor tyrosinkinas (EML4-ALK) fusion varianter från blodplasma10. I denna studie utökat vi dessa metoder för att inkludera högre ordningens multiplexade RNA mål för ROS1 och RET, som omfattar åtta fusion varianter inom varje analys. Syftet var att utveckla en snabb, känslig, specifika och reproducerbara teknik för detektion av dessa fusion varianter av plasma från patienter som tidigare diagnostiserats med NSCLC.
Testprocessen initieras i en läkares kontor använder RNA stabilisera blod insamling rör11. Dessa rör innehåller en cell konserveringsmedel samt RNase-hämmare. Prover är levererade prioritet natten till centraliserad College American patologer CAP-ackrediterade/kliniska laboratorium förbättring ändringsförslagen (CLIA)-certifierat laboratorium (Clinical Laboratory) för bearbetning av kompetent personal. När emot av kliniska laboratorium, utförs varje steg i bearbetningen enligt godkänd Standard Operating Procedures (SOP). Helblod centrifugeras för att återställa plasma, som sedan används för att isolera cirkulerande RNA som är antingen fritt i blodet eller inom encapsulating beståndsdelarna, såsom exosomes och trombocyter7,8,9. För att isolera RNA från dessa avdelningar, valt vi systemet för RNA återhämtning som bygger på jämförelser av flera extraktionsmetoder. Den isolerade RNA är koncentrerad och omvänd transkriberas till cDNA. Under optimering av metoden cDNA syntes att maximera ROS1 och RET mål avskrift konvertering10utvärderades flera omvänt transkriptas enzym och gen-specifika primers. Detta är avgörande för låg överflöd cirkulerande avskrifter, såsom tumör-derived fusion varianter. Slutligen, vi optimerat dPCR primer och sonden koncentrationer för multiplexering upptäckt av RET eller ROS1 fusion varianter och kontroll genen, glukuronidas-β (GUSB). Vi kombinerade sedan bästa förutsättningar från varje optimering studierna i en låst slutprotokollet innan du utför de analytic valideringsstudier som beskrivs i denna rapport. Detta protokoll och dessa resultat ligga till grund för en snabb och känslig arbetsflöde för rutinmässig detektion av sällsynta fusion varianter i omlopp.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

Vi har utvecklat nya metoder för isolering och karakterisering av tumör-derived cirkulerande ribonukleinsyra (cRNA) för blod-baserade flytande biopsi. Robust detektion av cRNA återhämtat sig från blod representerar en lösning till ett kritiskt otillfredsställda behov i klinisk diagnostik. Provningen börjar med insamling av helblod in blod insamling rören som innehåller konserveringsmedel som stabilisera cRNA. Cell-free, exosomal och trombocytantalet-associerad RNA är isolerad från plasma i detta testsystem. CRNA är omvänd transkriberas till kompletterande DNA (cDNA) och förstärks med hjälp av digitala polymeras-kedjereaktion (dPCR). Prover utvärderas för såväl de mål biomarkören som en kontroll gen. Test validering ingår gränsen för upptäckt, noggrannhet och robusthet studier med analytic prover. Den metod som utvecklats till följd av dessa studier reproducibly upptäcka flera fusion-varianter för ROS1 (C-Ros proto-onkogener 1; 8 varianter) och RET (ordnas under transfection proto-onkogener; 8 varianter). Prov bearbetning arbetsflödet har optimerats så att testresultat kan konsekvent genereras inom 72 timmar efter provet mottagandet.

Det här protokollet beskriver ett testsystem utvecklat för påvisande av RNA fusion varianter för användning i mätningen av drivrutinen mutationer inom plasma av NSCLC patienter (figur 1A). Fusion mRNA produkter från uttrycket av de vanligaste RET och ROS1 omflyttningar i NSCLC befolkningen var identifierade13,14,15,16,17. Multiplexa PCR assays utformades då att upptäcka de åtta vanligaste avskrift varianterna för varje mål i NSCLC inom en enda reaktion. De vanligaste flyttningar på det ROS1 locus generera föreningar med 5' portionr av CD74, SDC4, SLC34A2, EZR eller TPM3 gener (figur 1B). De vanligaste flyttningar på det RET locus leda till juxtaposition med KIF5B, som analysen omfattar sex exon korsningar. Ytterligare RET partners som omfattas är de med CCDC6 och TRIM33 (figur 1C). Totalt analyserna täcker ungefär 88% av ROS1 och 99% av RET förändringar förekommer i NSCLC patientpopulationen17.
Specificiteten av assay komponenterna utvärderades först med åtta individuella in vitro- RNAs som innehåller sekvensen mRNA för fusion avskrifter omfattas av ROS1 eller RET multiplexed analyser. Varje RNA Art testades mot varje individuell variant analys som omfattar den multiplexa versionen. Det fanns ingen korsreaktivitet av dessa analyser, analytisk specificitet inom utformad vilket visar 100% och multiplexed analyser (inga data anges). För att avgöra den lägre detektionsgräns på testprotokollet, total-RNA härrör från cellinjer som uttrycker en fusion variant ingår i analysen var blandade i en bakgrund av normala RNA vid koncentrationer som 5%, 1%, 0,2% och 0,04%. De multiplexade RET och ROS1 variant PCR assays upptäcks så lite som 0,2% fusion variant (figur 2A-B). Dessutom en beredning av 5% off-target cellinje härledda RNA (som uttrycker en EML4-ALK fusion avskrift) inte upptäcktes med multiplexade ROS1 och RET analyserna, vilket ytterligare visar specificitet (figur 2A-B).
Precision provning av RT-dPCR processen utfördes för båda ROS1 och RET. Analytic kontrollmaterial består av equimolar in vitro- RNAs bearbetades vid tre koncentrationer (hög, medel och låg) genom omvänd Transkription och dPCR på tre olika tillfällen inom samma dag (intradag), på tre dagar (mellan dag) och med två operatörer (Inter operator). Resultat från precision provning visat korrekt upptäckt av fusion avskriften av intresse, såväl som en kontroll gen, GUSB, som ingår som en inre QC metriska (figur 2 c-D).
Förutom den interna kontrollen för GUSB kördes varje tillverkningssats av kliniska prover med en uppsättning batch kontroller. En positiv kontroll utvecklades från en blandning av analytic in vitro RNA som representerade alla fusion varianter testas i RT-dPCR, samt analytiska in vitro- RNA för GUSB. Detta RNA var spetsade till normal human plasma lysate under RNA-extraktion och bearbetades tillsammans med de kliniska proverna i hela protokollet. Ingen omvänt transkriptas (nr RT) kontrollen var en negativ kontroll att bekräfta avsaknaden av kontaminerande material i arbetsflödet för RNA-extraktion och demonstrera specificiteten av primers för RNA. Kontrollen nr RT genererades med hjälp av samma material som positiv kontroll, men det omfattar inte enzymet inom cDNA syntes reaktionen. Inga RNA kontrollen (NRC) är en negativ kontroll att bekräfta avsaknaden av kontaminerande avskrifter i omvänd Transkription reaktion komponenter. Denna kontroll infördes i arbetsflödet vid cDNA syntesen steg, och vatten lades i reaktionen istället för en RNA-mall. Nr RT och NRC kontrollerna måste vara negativ i båda kanalerna, om korrekta resultat ska levereras. Tabell 1 visar omvänd Transkription reaktion komponenterna för varje kontroll. Exempel på 2D tomterna för var och en av dessa kontroller visas för ROS1 (figur 3 A-C) och RET (figur 3 E-G) multiplex analyser. Fusion varianter som hittades med en fluorescein amidite (FAM) sond och representeras längs y-axeln, medan genen kontroll, GUSB, upptäcktes med hjälp av en 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX) sond och på x-axeln. Dessa batch kontroller bedömdes under loppet av 21 dagar att fastställa analysens robusthet. Fusion positiva droppar och GUSB kontroll gen droppar observerades för ROS1 och RET i alla 21 körs avrättades under loppet av studien (figur 3D, H). Alla negativa kontroller (nr RT och NRC) gett negativa resultat över hela 21 dagar (inga data anges).
Förmågan att felsöka är en kritisk komponent i testprotokoll som ska köras i inställningen för kliniska laboratorier. Här, ger vi verkliga exempel på optimala resultat med RT-dPCR-protokollet. Först är en exempel 2D tomt visar vikten av ingen omvänt transkriptas kontroll (figur 4A). I det här exemplet var mutant positiva droppar närvarande trots att det var ingen cDNA omvandling på grund av brist på enzymet. Detta resultat var sannolikt på dPCR primers förstärkande off-target genomiskt DNA. I det här fallet kommer design av ett intron-spänner test förhindra amplifiering av genomisk DNA. Alternativt, ett RNase-fri DNAS enzym kan användas för att eliminera kontaminerande DNA, men detta rekommenderas inte för detektion av sällsynta mål, eftersom vissa RNA nedbrytning kan uppstå under inkubation med enzymet. Nästa exempel 2D tomten var en NRC med positiva droppar i båda kanalerna (figur 4B). Detta anges kontaminering vid något tillfälle i inställningar för RT-dPCR. I detta fall är rekommendationen att kassera eventuella potentiellt förorenade reagenser som används i tester, grundligt sanera all utrustning och testa med färsk reaktion komponenter. Tredje exempel 2D tomten presenteras som en spray av droppar längs en 45° linje (figur 4C). Detta orsakas ofta av klippning och växa samman av droppar. Försiktig droplet hantering före termisk cykling är viktigt, som droppar är benägna att skada. Vi rekommenderar användning av automatiserade droplet generation, när det är tillgängligt. Om överföring manuellt genererade droppar, vara säker på att välja de rekommendera wide-bore-tips och anställa försiktig pipettering teknik. Droplet överföring kräver långsam aspiration och dispensering, med varje äger rum över 5-6 sekunder, och det är viktigt att pipett tip öppningen inte touch droplet patronen eller väl. När dispensering, hålla pipettspetsen på flytande nivå och höja den långsamt droppar är expedierade (Visa video demonstration). Slutliga 2D tomt exemplet visar en brist på separation mellan de positiva och negativa droplet populationerna (figur 4 d). Detta kan ha flera orsaker. Stark PCR-hämmare, såsom rengöringsmedel används i Lys buffertar och ett överskott av starkt försämrat DNA, kan orsaka förlust av separation. I detta fall överväga att lägga till en sanering steg mellan cDNA syntes och dPCR (såsom beskrivs i steg 5 i detta protokoll). Slutligen, avsaknaden av separation kan också bero på suboptimala förstärkning villkor och optimering av PCR-steget bör också övervägas.
Data i figur 5 representerar 984 verkliga världen patienten prova leveranstider och visar den snabba naturen av detta test arbetsflöde. Resultaten rapporterades till behandlande läkare så tidigt som inom 48 timmar (79% av fallen) prov mottagandet och i 95% av fallen, inom 72 timmar. Sammanfattningsvis, kan användning av stabiliserad cirkulerande RNA blod insamling rör, optimerad RNA extraktion förfaranden från blod och RT-dPCR körs enligt ett optimerat protokoll med lämpliga interna och batch kontroller, ge en snabb testsystem för korrekt påvisande av fusion RNA varianter relevant i NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Figur 1 : Översikt över blod prov bearbetning steg för Fusion Variant upptäckt med specifika analyser för den mest utbredda RET och ROS1 varianter i NSCLC. (A) provtagning initieras när helblod dras och en BCT levereras inom specimen collection kit till kliniska laboratorium. Cirkulerande RNA återvinns från flera källor inom trombocyt-berikad plasma, återför transkriberas med gen specifika priming och renas för användning i dPCR. Prover bearbetas med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga system som består av droplet generation (emulsion), förstärkning, och droplet räknar. Data analyseras med hjälp av kommersiellt tillgängliga program. Testresultaten är sedan dokumenteras och rapporteras tillbaka till test-begär läkaren. Processen är utformad för att fungera inom en tidsram av 72 timmar från provet mottogs resultat release. Åtta varianter för (B) ROS1 och (C) RET omfattas inom multiplexade analyserna. Anpassad från Biodesix hemsida med tillstånd. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Figur 2 : Analytic validering. Cell-linjer uttrycker (A) SDC4-ROS1 fusion och (B) CCDC6-RET fusion späddes i en bakgrund av totala mänskliga vildtyps-RNA (WT RNA). Med varje fusion variant bildades detektionsgränsen på 0,2% variant frekvens med hjälp av fördefinierade kriterier för varje variant assay. Alla prover över denna tröskel också innehöll minst 21 kopior av kontroll-genen. 5% EML4-ALK (ALK) standarden i en bakgrund med vildtyp RNA testades för att demonstrera analysens specificitet, vilket bekräftades av ett negativt resultat. Analytic multiplexade RNA standarder mättes vid höga, medelhöga och låga koncentrationer (C) ROS1 och (D) RET. Precision utvärderades över tre körningar på samma dag (intradag), tre körningar på tre dagar (mellan dag) och med två oberoende operatörer (Inter operator). Kopienummer och standardavvikelser visas. Anpassad från Biodesix hemsida med tillstånd. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Figur 3 : Batch-bearbetning Control exempel och robusthet Data. 2D tomt på den ROS1 multiplex assay dPCR resultat för (A) positiv kontroll, (B) ingen omvänt transkriptas kontroll, och (C) inga RNA mall kontroll. (D) kontroller kördes på 21 dagar (exklusive helger och helgdagar). Medeltal kopia +/-standardavvikelser för ROS1 positiv kontroll var 439 + / 141. Ingen omvänt transkriptas och ingen mall kontroller var också köras på varje dag, och dessa var alla negativa (inga data anges). 2D tomt på den RET multiplex assay dPCR resultat för (E) positiv kontroll, (F) inget omvänt transkriptas kontroll och (G) ingen RNA mall kontroll. (H) kontroller kördes på 21 dagar (exklusive helger och helgdagar). Menar kopior +/-standardavvikelser för RET positiv kontroll var 586 + / 182. Inte visas är ingen omvänt transkriptas och ingen mall kontroller som kördes också på varje dag och var alla negativa. Anpassad från Biodesix hemsida med tillstånd. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Figur 4 : Felsökning RT-dPCR. 2D tomter som representerar suboptimala dPCR resultat erhålls när det finns (A) kontaminering inom ingen omvänd transkriptas kontroll, (B) kontaminering inom den inga RNA kontrollen, (C) klippning och växa samman av droppar och (D ) dåligt optimerat PCR villkor eller PCR-hämning. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Figur 5 : Handläggningstid (TAT). TAT (i timmar) sammanställdes för tester som begär en RNA-variant (n = 984). Data utesluter helger, helgdagar och prover som innehas för > 24 h på grund av ofullständig klinisk information om laboratoriet formulär för Test. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tabell 1: Beredning av omvänd Transkription reagenser för processreglering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix för prober (ingen 2'-deoxiuridin 5'-trifosfat)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x variant mål primers/sonder inställd (450 nmol/L primers, 250 nmol/L FAM probe)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x kontroll uppsatt primers/sond (450 nmol/L primers, 250 nmol/L HEX probe)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuclease-gratis vatten</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Beredning av master mix för dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cykling steg</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
			<td># Cykler</td>
			<td>Ramp Rate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym aktivering</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glödgning/förlängning</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzym inaktivering</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Håll (tillval)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>oändlig</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Termisk cykling villkor.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-baserat Test för påvisande av ROS1 och RET Fusion avskrifter från cirkulerande ribonukleinsyra använder digitala Polymerase Chain Reaction

Påvisande av cirkulerande ribonukleinsyra (cRNA) från blod är en icke tillgodosett behov i klinisk diagnostik. Här beskriver vi metoder som kännetecknar cRNA från icke-small cell lung cancerpatienter med hjälp av känsliga och specifika digitala polymeraskedjereaktion. Testerna krav design att upptäcka fusion varianter inom 72 timmar.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Kvantitativa Visualisering och detektion av hudcancer Använda dynamiska Värmekameror

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

Den Trier Social Stress Test protokoll för att framkalla psykisk stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Snabb Cell-free CD4 Enumeration Använda Hela Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminiscens Imaging (CLI) för cancerbehandling övervakning

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Bedömning av magtömning i icke-feta diabetiska möss Använda en [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-oktansyra utandningstest

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolering och förökning av cirkulerande tumörceller från en mus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Romanen diagnostik i Revision artroplastik: implantat ultraljudsbehandling och Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smak prov: En kort och validerade Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Digital PCR för kvantifiering av cirkulerande mikroRNA i akut hjärtinfarkt och hjärt-kärlsjukdom

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test

Traditionella Trail Making test ändras till helt nya bedömningsverktyg: Digital och Walking Trail göra test

The Trail Making Test (TMT) is a well-accepted tool for evaluating executive function. The standard TMT was invented more than 60 years ago and has been ...