Name: fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00
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この作品は、NIH (RO1 NS090390) によって支えられました。博士ジョアン Steffanfor 技術支援とこの試金の開発の間に議論に感謝も申し上げます。

動物の倫理の声明 - 実験が実施されたケアと健康の国民の協会および制度的動物ケアおよび使用委員会 (承認された動物の研究プロトコルの実験動物の使用のためのガイドに従い、IACUC) カリフォルニア大学アーバイン校、AAALAC 認定機関。すべての努力は、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われました。
1. 換散バッファーの準備
<ol><li>「水溶性」の換散バッファー?...

<ol>
	<li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington's+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo.">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li><li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+expansion+disease:+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis.">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li><li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+neuropathology+of+Huntington's+disease.">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues.">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li><li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington's+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington's+disease+neurodegeneration.">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li><li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington's+Disease+pathology.">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li><li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrantly+spliced+HTT,+a+new+player+in+Huntington's+disease+pathogenesis.">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li><li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington's+disease+patients.">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).</li><li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington's+disease.">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li><li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions.">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li><li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington's+Disease.">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation.">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li><li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1.">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li><li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila.">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules.">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li><li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex.">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington's+disease+models.">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li><li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons.">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73 (2009).</li><li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRiC's+tricks+inhibit+huntingtin+aggregation.">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation.">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li><li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies.">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li></ol>

定量的な一貫性のある結果を確保するため上記のプロトコルのいくつかの対策が必要です。両方分数で mHTT が複数の凍結融解時に時間をかけて集計を自発的に形成するまず、特に高濃度で。したがって、タンパク質プレップの因数を凍結し、上記のプロトコルで説明されているように分析を実行する前に必要な量のみを解凍するが重要です。さらに、不溶性画分利回り融解時に白い鉛塩法は?...

適切な折りたたみをするタンパク質品質管理ネットワークの中断、細胞蛋白質の低下はアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、病理学に可能性が高い中央および他の「タンパク」2,3 を障害します。プロテオステイシス ネットワーク コンポーネントおよび病理学への貢献の詳細な理解したがって改善の治療上の介在を開発することが重要です。HD は polyglutamines (polyQ) (HTT) huntingtin 蛋白質4での拡張されたストレッチの結果 HD 遺伝子内の CAG リピートの異常な拡張によって引き起こされます。HD 発症の一貫した病理学的機能、蓄積、および正常細胞の恒常性と機能にいくつかの方法で干渉する示されている HTT 脳の地域および末梢組織での集計は、結果として得られる折りたたみとして、します。5,6。 中の HTT は普遍的表現、線条体中とげだらけニューロンは、選択的に脆弱性が存在と影響を受ける最もあからさま HD 病因にも関連付けられている注目すべき皮質萎縮。
脳内 HD 患者と動物モデルの HTT の集合体の形成は通常病気の進行とドミナント ネガティブ益 mHTT7の関数のプロキシ マーカーを務めています。どのタンパク質の折りたたみと集約に貢献するかもしれない mHTT 誘発毒性正確なメカニズムは不明と様々 な動物モデルの HD 患者の頭脳のこれらの介在物の生成は、不変、必然的な機能です。介在物表示を蓄積した HTT 断片を N 末端の主構成するその分解を示す polyQ を拡大し、9 8,をスプライシングの代替と同様、フルレングスの HTT の処理再生ことがあります、HTT ビジュアルエフェクト N 末端フラグメントの病因に重要な役割は、急速に集計することができます、核と加速や集計プロセス10を伝達する HTT の病理学的フォームを構成するかもしれない。
ただし、これらの介在物の存在では、HTT による毒性や細胞死11と必ずしも関連しません。HTT は不溶性の集計および介在物12に可溶性オリゴマー種と β シート線維を通じて水溶性モノマーから集計プロセスを経るに提案されています。標準生化学的アッセイを介してこれらの様々 な蛋白質種を解決する低洗剤換散バッファーで安定性と標準的な生化学的アッセイを使用して可視化の難しさのためフィールドで課題となっています。したがって、方法論的考察、程度や蓄積・集計 mHTT のパターンを検出するに重要です。
ここで提示されたプロトコルは HTT は、具体的に HD 病因と病気進行1,13 と密接に追跡するために表示される不溶性の HMW HTT 種の形成のいくつかの中間を可視化するメソッドを提供します。、14。解決および mHTT の複数の種を追跡することは、研究者に病因を研究し、変調して病気の発症に影響を与える潜在的な治療上の介在を評価する生化学的なツールを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP505RE</td>
			<td>Screw cap, sterile vaccum filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Model Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000111</td>
			<td>Comparable to Lowry assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M buffer solution</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 5M solution</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfony flouride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Create 0.5M stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>Create 10mg/ml stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td>Create 10mg/ml stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4504</td>
			<td>Create 500mM stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HTT</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td>Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56875</td>
			<td>Use 1:1000 for soluble western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species

誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、ハンティントン病 (HD) および他の多くの神経変性疾患の中心です。具体的には、HD の病理学的特徴は高分子量複合体に突然変異体の HTT (mHTT) 蛋白の異常な蓄積、断片および他の蛋白質の細胞内封入体が構成されます。測定および蛍光顕微鏡、西部のしみの分析、フィルターなどの mHTT を含む集計の様々 な形の貢献を理解する従来の方法は、アッセイをトラップします。
ただし、これらのメソッドのほとんどは、特定の構造、したがって mHTT タンパク質フラックス集計溶解度と解像度の複雑な性質のための完全な状態を解決できません。
集計 mHTT の変更されたフォームと複合体の様々 な識別、分離、細胞凝集体とフラグメントの可溶化は必須です。ここで分離し、可溶性 mHTT、モノマー、オリゴマー、フラグメントを視覚化する手法について述べるし、不溶性の高分子量分画法蓄積 mHTT 種。HMW mHTT を追跡、病気の進行とマウス動作の読み出しに対応し、有益ある特定の治療上の介在の1によって調整されています。この方法は、マウスの脳、末梢の組織および細胞培養で使用できるが他のモデル システムや疾患のコンテキストに適応することがあります。

水溶性と不溶性のセル lysates 分別を次の解像度は、ウエスタン解析とフィルター障害アッセイ (図 2) を使用して検出できます。例として HEK293T 細胞のトランスフェクション試薬 (例えば、lipofectamine 2000) を使用してを導入させた、HTT エクソン 1 エンコード cDNA 97 グルタミンを含む繰り返し15ポリ プロリンの豊富な地域に?...

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Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

不溶解性および溶ける変異ハンチンチン種マウス脳と細胞培養からの分別の方法を説明します。記載されているメソッドは、特性評価および huntingtin 蛋白質フラックスと病気の発症と摂動存在下での蛋白質の恒常性の分析にエイズの定量化の便利

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

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ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

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ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...