Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Denne forskning er støttet af forskning for at forebygge blindhed, New York, www.rpbusa.org og den større New York Center for Retinal degenerativ sygdom Foundation Fighting blindhed, www.blindness.org. Forfatterne vil gerne takke Luanna Bartholomew, Ph.D., for hendes kritiske gennemgang af dette manuskript.

Følgende protokol er udført i tilslutning til grundsætningerne af Helsinki-erklæringen og retningslinjerne for Yale University menneskelige videnskabsetisk Komité.
1. sourcing menneskelige Donor øjne
<ol><li>Få menneskelige donor glober fra den nationale sygdom forskning Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Afhængigt af projektet, skal du forberede ikke mindre end tre par af donor øjne for hver eksperimentelle gruppe.</li>
	<li>Enucleate donor øjne inden for 10 h og skibet inden for 48 timer efter slagtning. Derefter transportere øjne til laboratoriet i sterile Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) kultur medium på is. Tidligere har rapporteret undersøgelser vist, at donor øjne høstes og transporteres i denne mode forbeholdt de biologiske funktioner og aktiviteter i Bruchs membran25,26,29.</li>
</ol>2. høst af menneskelige Bruchs membran Explants
<ol><li>Sted hvert øje på en 1,5 x 1,5 tommer gaze gennemblødt med kuldioxid-uafhængig DMEM medier i en 100 mm kultur parabol, og brug fine blade saks til at gøre et snit gennem sclera 3 mm posteriort for limbus og circumferentially udvidelse i begge retninger.</li>
	<li>Gøre en fuld-tykkelse omkredsen indsnit (trænge igennem til glaslegemet) 1 mm posteriort for ora serrata. Fjern og kassér den forreste segment (hornhinden, linsen og iris), glaslegemet og nethinden.</li>
	<li>Brug fine kirurgisk saks til at gøre fire radiale incisioner sclera og årehinden, og derefter skræl sclera fra periferien til synsnerven, samtidig undgå rive choroidea/Bruchs membran komplekse.</li>
	<li>Næste, lave en omkredsen snit gennem suprachoroidal plads langs ora serrata og skræl ÅV-Bruchs membran-choroidea kompleks posteriort fra sclera.</li>
	<li>Fjern indfødte ÅV celler ved badning eksplantat med 0,02 M ammoniumhydroxid i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) i en 60 x 15 mm polystyren petriskål i 20 min. ved stuetemperatur, efterfulgt af vask det tre gange i DPBS (figur 1).</li>
	<li>Flyde Bruchs membran kompleks eksplantat i CO2-fri medier over en unlaminated, hydrofobe 65 µm tykt polytetrafluorethylen membran med 0,2 µm porer, med basal lamina lag af hver eksplantat vender membranen.</li>
	<li>Placer en Teflon membran med Bruchs membran eksplantat på en fritted glas støtte i et glas mikroanalyser vakuum filterholderen system.</li>
	<li>Flatten de krøllede kanter fra choroidal side med fine pincet belagt med Teflon, pas på ikke for at røre Bruchs membran basal laminin side.</li>
	<li>Heat 15 mL Agarosen (4% i DPBS) og derefter afkøles det til 37 ° C. Derefter hældes 15 mL af liquidized gel på Bruchs membran-choroidea kompleks fra choroidal-side mens anvendelse blide suge for at garantere, at eksplantat vil forblive flad. Holde væv ved 4 ° C i 2-3 min. til at befæste Agarosen og derefter skræl polytetrafluorethylen membranen væk.</li>
	<li>Placer Bruchs membran eksplantat (1,5 inches i diameter, inden for størknede agarosegel) i en 60 x 15 mm polystyren celle kultur parabol (med Bruchs membran opad) der har været foret med varmt flydende Agarosen i bunden af fadet kan lave Bruchs membran explant i bunden af brønden med eksplantat basal laminin lag vender opad.</li>
	<li>Agarosen vil størkne inden for 2-3 min. ved stuetemperatur til at stabilisere Bruchs membran explants i kultur parabol. Cover Bruchs membran explants i kulturen fad med DPBS og gemme parabol ved 4 ° C til fremtidig brug. Figur 2A viser den isolerede Bruchs membran explants i en 60 x 15 mm kultur parabol.</li>
	<li>Hvis den ønskede kultur system er i en 96-brønd plade, placere Bruchs membran eksplantat (1,5 inches i diameter, med størknede agarosegel) på en flad Teflon ark med laminin-side op.</li>
	<li>Ved hjælp af en trephine, skæres fem eller seks, 6 mm-cirkulære knapper fra Bruchs membran komplekse explant og læg hver på 4% Agarosen ved 37 ° C i en ikke-behandlet polystyren godt af en 96-brønd plade. Agarosen vil størkne inden for 2-3 min. ved stuetemperatur til rette Bruchs membran explants (knapper) i bunden af hver brønd. Bemærk: Figur 2B viser trephined Bruchs membran knapper i en 96-brønd plade. Typisk, 9-11 knapper eller explants kan høstes fra hvert øje.</li>
</ol>3. dyrkning af retinale Pigment epitel (ÅV) celler på menneskelige Bruchs membran Explants
<ol><li>Ved modtagelsen af donor øjne, rense den ekstraokulær væv med DPBS. Gøre en omkredsen snit 5 mm under iris-sclera touch point (pars plana) ind i subretinal rummet. Kassér den forreste segment, glaslegemet og nethinden.</li>
	<li>Vask øjestykket, som indeholder Bruchs membran og ÅV ark, med kolde DPBS. Adskille ÅV celler med 5 mL 0,25% trypsin længere end 10 min for hver eye prøve. Dæmpning trypsin reaktion med 25 mL af DMEM komplet medium med 15% føtal bovint serum (FBS) varmes ved 37 ° C i et 50 mL reagensglas.</li>
	<li>Centrifugeres celler på 200 × g i 10 min. ved 24 ° C, og resuspenderes i 5 mL af DMEM komplet medium (med 15% FBS).</li>
	<li>Tælle cellerne og frø 15.000 levedygtige ÅV celler på basal lamina af hver forskellige alderen Bruchs membran explants (knapper) i en 96-brønd plade i 200 µL af serumfrit minimum essential medier (MEM) indeholdende antibiotika (100 IE/mL penicillin G, 100 mg / mL streptomycin, 5 mg/mL gentamicin og 2,5 mg/mL amphotericin B). Antager en celle diameter på 20 µm, plating på denne tæthed vil tillade ÅV celler til at dække ca. 15% af området plating.</li>
	<li>Plade celler på knappen, hvorved cellen tæthed kan derefter øges trinvis op til 100% sammenløbet afhængigt af effekten af hver parameter på celle adfærd.</li>
	<li>Tillad cellerne at tillægge eksplantat for 24 h i en fugtig atmosfære af 95% air/5% CO2 ved 37 ° C. Forsigtigt ændre medium med varm komplet DMEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Ingen af forfatterne har nogen kommercielle oplysninger til at erklære.

Alderen menneskelige Bruchs membran (ekstracellulære matrix) bidrager til sygdomsprogression af AMD og der er således behov for at forstå hvordan denne ændrede matrix bidrager til ÅV celle dysfunktion. I betragtning af manglen på tilstrækkelige dyremodeller for at studere Aldersrelaterede forandringer i AMD, kan ex vivo modelsystemer der efterligner virkningen af sygdom tjene som et værdifuldt redskab til at forstå patofysiologien. Den metode, der beskrives i dette håndskrift kan bruges konsekvent isolere menneskelige Bruchs membran explants og kultur ÅV celler, herunder primær, udødeliggjort eller stamcelle-afledt ÅV cellelinjer.
Som nævnt tidligere, er menneskelige Bruchs membran explants indkøbt fra NDRI. En protokol, der er etableret med NDRI, der angiver kriterier for donor øjne at være acceptabel. For eksempel, donorer skal have ingen kendte retinal øjensygdomme, øjne/glober er hentet inden for 10 timer efter døden og glober ankommer til laboratoriet inden for 48 timer efter døden (via overnight pakke levering på is). Angiv den relevante aldersgruppe og antallet af øjne brug for statistisk analyse af undersøgelsen, fx., fem par af glober fra donorer i alderen 20-49 år og fem globe par fra donorer i alderen mellem 50-89 år.
Tilgængeligheden af øjet glober varierer generelt gennemsnit ti par af glober rådighed hver måned. Øjet pakke ankommer med grundlæggende, de identificerede donor oplysninger: alder, race, dødstidspunktet, dødsårsag, og kort forbi sygehistorie (sygdom notering eller co-morbiditet).
Vigtigst, kræver høst menneskelige Bruchs membran explants fjernelse af den forreste segment af øjet og glasagtige, giver mulighed for isolation af ÅV-Bruchs membran-choroidea kompleks. Når Bruchs membran er isoleret, kan ÅV celler seedede på de acellulær explants ved varierende koncentrationer og kulturperler for downstream eksperimenter. Forberedelse og proceduremæssig håndtering som beskrevet heri er kritisk, være opmærksom på orientering af den isolerede Bruchs membran til at sikre den laminal overflade vender-op mens du ikke rører overfladen mekanisk for at undgå at beskadige den ekstracellulær matrix overfladestruktur.
Det skal også bemærkes, at når du bruger Bruchs membran eksplantat systemer, der er nogle variabler, der kan påvirke resultaterne af downstream eksperimenter som enkelte donor genomisk baggrund, alder af Bruchs membran eller postmortem tid af Bruchs membran, og placeringen af Bruchs membran, dvs., centrale eller perifere del af Bruchs membran explants. Som med alle andre menneskelige væv undersøgelse, skal man rekruttere passende donor øje prøvenummer for at have den nødvendige statistiske magt og matche donor øje alder eventuelt. Fastsættelse af strenge kriterier for at acceptere øjne fra øjet banker er et afgørende parameter. Kun acceptere øjne der er kerneløse mindre end 10 h postmortem og som Bruchs membran forberedelse kan høstes inden for 24-48 timer efter døden. Webstedet synsnerven kan anvendes som markør for orientering, og bruge de samme steder for eksperimenterende og styre studiegrupper. Ved at træffe disse foranstaltninger, kan man minimere eksperimentel variation.
I Resumé, forståelse af ÅV-Bruchs membran-choroidea kompleks og hvordan det påvirkes af alder og sygdom er afgørende for at forstå dens bidrag til patofysiologien af AMD. Modelsystemer, der beskæftiger ex vivo teknikker er et værdifuldt redskab til at undersøge disse effekter ved hjælp af menneskelige væv. Heri, beskriver vi en metode, der beskæftiger menneskelige donor explants som relevante ex vivo model af alderen Bruchs membran. Denne teknik gør det muligt at bruge alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran som et forsknings-værktøj til at undersøge, hvordan strukturelle ændringer inden for matrixen kan påvirke overliggende ÅV celle adfærd herunder udlæg, spredning og gen expression25 , 27. vellykket udvikling af lignende ex vivo modelsystemer vil fremme vores forståelse af AMD og lette udviklingen af nye terapeutiske muligheder.

Aldersrelaterede strukturelle ændringer til menneskelige Bruchs membran, som er forårsaget af mange faktorer, herunder nitrosative og oxidativ stress, udøver flere skadelige virkninger på funktionen af retinale pigment epitel (ÅV) celler og bidrager til den patologi af aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Når de overvejer celleudskiftnings for avancerede atrofisk AMD eller geografisk atrofi, vil behandling sandsynligvis kræve transplantation af celler på en seng af ÅV celle atrofi. Aldersrelaterede forandringer i menneskelige Bruchs membran kan påvirke succes af transplanterede ÅV celle grafts, givet at skaden til ekstracellulære matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating menneskelige Bruchs membran biologi og hvordan strukturelle ændringer inden for matrixen bidrage til progression til AMD er afgørende for at forstå sygdom patologi. Der er således et kritisk behov for efterforskere i feltet aldersbetingede øje at udvikle protokoller, der beskriver ex vivo høst af alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran.
Historisk set har det været svært at model aldersbetingede lidelser såsom geografisk atrofi og en ældre menneskers Bruchs membran i dyr23. Dette problem skyldes flere faktorer herunder levetiden af mennesker i forhold til gnavere og andre arter, der ofte anvendes for sygdom modellering, samt manglen på en gule plet i de fleste hvirveldyr24. Fordelen ved metoden beskrevet heri er, at cellerne kan testes direkte på Bruchs membran udvundet fra post mortem øjne af alderen og/eller syge enkeltpersoner. Det overordnede mål med denne artikel er at fremlægge en detaljeret metodologi for en ex vivo model af alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran, herunder isolering af menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige donorer og såning af ÅV celler til downstream eksperimenter. Denne model kan tjene som en relevant model til at undersøge bidrag af ekstracellulære matrix skader på ÅV celle funktion og patologi20,25,26,27,28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Bortset fra vitaminer og antioxidanter anbefalet af den aldersbetingede øjensygdom Study, er der ingen effektiv behandling for "tørre", eller atrofisk aldersrelateret makuladegeneration (AMD) som udgør 90% af tilfældene. Behandlinger er nødvendige for at bremse eller forsinke udviklingen af geografisk atrofi (GA), og forstå Bruchs membran patologi er en del af denne proces. Ændringer i menneskelige Bruchs membran foran progression af AMD ved at bidrage til beskadigelse af retinale pigment epitel (ÅV) celler. I betragtning af manglen på tilstrækkelige dyremodeller for at studere AMD, tjene ex vivo modeller for alderen menneskelige Bruchs membran som et nyttigt redskab til at undersøge funktionaliteten af ÅV celler fra udødeliggjort og primære cellelinjer samt ÅV linjer afledt af induceret pluripotente stamceller celler (iPSCs). Vi præsenterer her, en detaljeret metode, der gør det muligt at fastslå virkningerne af ÅV celle adfærd seedede på høstede menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige donorer, herunder udlæg, apoptose og spredning, evnen til at phagocytize fotoreceptor ydre segmenter, etablering af polaritet og genekspression. Denne analyse giver en ex vivo model af alderen Bruchs membran til at vurdere de funktionelle egenskaber af ÅV celler når seedede på alderen/kompromitteret ekstracellulære matrix.

Når denne protokol er udført korrekt, kan man bestemme virkningerne af alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran på ÅV cellefunktion ved etablering af polaritet og ydre blod retinal barriere, polariseret sekretion af vækstfaktorer og cytokiner, og fagocytose af fotoreceptor stangen ydre segmenter.
Vi har genereret dataene, der demonstrerer en sygdom fænotype på alderen menneskelige Bruchs membran. For eksempel alderen dyrkning ÅV celler på menneskelige Bruchs membran explants falder ÅV celle limning (figur 3). ÅV celler dyrkes på alderen menneskelige Bruchs membran reducerer kapaciteten af disse celler til phagocytize stang ydre segmenter (ROS), en kritisk ÅV funktion (figur 4). Derudover kan apoptotiske celler identificeres og sammenlignes på disse knap explants ved hjælp af en terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) plet som beskrevet i tidligere arbejde26. Virkningerne af en alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran på ÅV celle gen expression profil kan bestemmes ved hjælp af microarray teknologi. Vi har demonstreret, at RPE celle genekspression ændres når kulturperler på menneskelige Bruchs membran fra ældre personer i forhold til explants fra yngre individer (figur 5)27. Til statistisk analyse bruges explants fra mindst 3-5 menneskelige donorer pr. gruppe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figur 1. Skematisk fremstilling af isolation af menneskelige Bruchs membran fra donor øjne. Menneskelige Bruch membraner høstes ved at fjerne sclera, anterior segment, nethinden, glasagtige, og indfødte retinal pigment epitel (ÅV) celler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figur 2. Isolerede menneskelige Bruchs membran (BM) i en kultur fad. (A) skematisk af menneskelige Bruchs membran explants (hver 1,5 inches i diameter, med størknede agarosegel) placeret i en 60 × 15 mm polystyren celle kultur parabol (BM opad) fyldt med varm flydende Agarosen i bunden af fadet. (B) en menneskelig Bruchs membran eksplantat, der har været trephined i et par 6 mm runde knapper (explants), hver ow som blev derefter sat på 4% Agarosen ved 37 ° C i en ikke-behandlet polystyren godt af en 96-brønd plade. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figur 3. Retinale pigment epitel (ÅV) celle limning sats på unge og ældre menneskers Bruchs membran (BM). Primære ÅV celler var seedet på menneskelige Bruchs membran explants fra young (< 50-års-alderen, n = 3) eller ældre (> 70 år gamle, n = 5) donor øjne for tre uger. Vedhæftet fil cellehastighed blev målt af MTT celle levedygtighed assay. Ældre menneskers Bruchs membraner reduceret ÅV cellehastighed vedhæftet fil med 24% (unge BM 100 +/-8,54 S.E. vs ældre BM 76.65 +/-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = standardafvigelse.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figur 4. Retinale pigment epitel (ÅV) celle fagocytose påvirkes af alder af den menneskelige Bruchs membran (BM). Primære ÅV celler dyrkes på ældre menneskers Bruchs membran explants havde en nedsat evne til at phagocytize stang ydre segmenter (ROS) (unge BM 873 +/-9.3 S.E., n = 5 vs ældre BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = standardafvigelse.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figur 5. Antallet af retinal pigment epitel (ÅV) celle gener udtrykt i hver prøve kulturperler på unge eller ældre menneskers Bruchs membran explants. Der var flere scatter i antallet af gener udtrykt i primære ÅV celler seedede på ældre versus yngre menneskers Bruchs membran (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, henholdsvis); fem explants blev testet for hver aldersgruppe. Præsenteret med fuld tilladelse fra alle forfattere af Cai, H mfl. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Målet med denne protokol er at demonstrere dyrkning af retinale pigment epitel (ÅV) celler på alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran. Denne metode er velegnet til at studere ÅV celle adfærd på en kompromitteret ekstracellulære matrix.

Dyrkning af retinale Pigment epitel celler på en Ex Vivo Model af alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Udledning af retinale pigmentepitel Celler fra stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Følger retinale pigmentepitel (RPE) fra induceret Pluripotente Stem (IPS) Celler ved forskellige størrelser af embryoide legemer

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering af en klinisk relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Model for Undersøgelse Epithelial Wound Reparation i en Native mikromiljø

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Sporing af menneskers fedt-afledt mesenkymale stamceller i en rotte knæet slidgigt Model med fluorescerende lipofile membran farvestof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering Transplantation-egnet retinale Pigment epitelvæv stammer fra menneskelige embryonale stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...