Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Dit onderzoek is gesteund door onderzoek te voorkomen blindheid, New York, www.rpbusa.org en de Greater New York Center voor retinale degeneratieve ziekte Stichting bestrijding van blinden en slechtzienden, www.blindness.org. De auteurs bedank Luanna Bartholomew, Ph.D., voor haar kritische evaluatie van dit manuscript.

Het volgende protocol wordt uitgevoerd in de naleving van de beginselen van de verklaring van Helsinki en de Yale universiteit Comité voor ethiek van menselijk onderzoek richtsnoeren.
1. sourcing menselijke Donor ogen
<ol><li>Verkrijgen dat menselijke donor globes de nationale ziekte onderzoek Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Afhankelijk van het project, door maar liefst drie paren van donor ogen te voorbereiden door elke experimentele groep.</li>
	<li>Enucleate donor ogen binnen 10 uur en schip binnen 48 uur na het slachten. Vervolgens vervoer de ogen naar het laboratorium in steriele Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium (DMEM) kweekmedium op ijs. Eerder hebben gerapporteerde studies aangetoond dat de donor ogen geoogst en vervoerd in deze mode behouden de biologische functies en activiteiten van de Bruch membraan25,26,29.</li>
</ol>2. oogsten van menselijke Bruch van membraan Explants
<ol><li>Plaats elk oog op een 1.5 x 1.5 inch gaas met kooldioxide-onafhankelijke DMEM media in een 100 mm cultuur schotel, en gebruik fijn blad schaar doorweekt te maken van een incisie door de sclera 3 mm posterieure aan de limbus en omtrek uit te breiden in beide richtingen.</li>
	<li>Maak een posterior 1 mm volledig-dikte ze insnijding (indringend aan glasvocht) naar de ora serrata. Verwijder en verwerp het anterieure segment (hoornvlies, lens, en iris), het glasvocht en het netvlies.</li>
	<li>Fijne chirurgische schaar gebruiken om vier radiaal insnijdingen tussen de sclera en vaatvlies, en vervolgens de sclera schil uit de buurt van de periferie de oogzenuw, terwijl verzorgen om te voorkomen dat het vaatvlies/Bruch membraan complexe scheuren.</li>
	<li>Vervolgens Maak een ze incisie door de ruimte van de suprachoroidal langs de ora serrata en schil de RPE-Bruch membraan-vaatvlies complex posteriorly uit de sclera.</li>
	<li>Native RPE cellen verwijderen door het zwemwater de explant met 0,02 M ammoniumhydroxide in Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) in een 60 x 15 mm polystyreen petrischaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie - keer wassen in DPBS (Figuur 1).</li>
	<li>Zweven van de Bruch membraan complexe explant in kooldioxide-vrije media over een unlaminated, hydrofobe 65 µm dik polytetrafluorethyleen membraan met 0,2 µm poriën, met de basale lamina laag van elke explant geconfronteerd met het membraan.</li>
	<li>Plaats een polytetrafluorethyleen membraan met Bruch van membraan explant op een drager van fritted glas in een glas Microanalyse vacuüm filterhouder systeem.</li>
	<li>De gekrulde randen van de choroidal kant plat met een fijne Tang gecoat met Teflon, verzorgen niet te raken van de Bruch membraan basale laminin kant.</li>
	<li>Verwarm 15 mL agarose (4% in DPBS) en vervolgens afkoelen tot 37 ° C. Giet vervolgens 15 mL van de liquidized gel op de de Bruch membraan-vaatvlies complex van de choroidal-kant tijdens het toepassen van zachte zuigkracht om te garanderen dat de explant vlak zal blijven. Het weefsel bij 4 ° C gedurende 2-3 minuten om te stollen de agarose en vervolgens schil het membraan van polytetrafluorethyleen weg houden.</li>
	<li>Plaats van de Bruch membraan explant (1,5 inch diameter, binnen gestolde agarose gel) in een 60 x 15 mm polystyreen cel cultuur schotel (met Bruch van membraan naar boven) dat heeft zijn bekleed met warme vloeibare agarose op de bodem van de schotel te lossen van de Bruch membraan explant op de bodem van de put met de explant basale laminin laag naar boven.</li>
	<li>De agarose zal stollen binnen 2-3 minuten bij kamertemperatuur te stabiliseren van de Bruch membraan explantaten in de cultuur-schotel. Dekking van de Bruch membraan explants in de cultuur schotel met DPBS en de schotel bij 4 ° C voor toekomstig gebruik opslaan. Figuur 2A toont dat de geïsoleerde Bruch membraan explants in een schotel van 60 x 15 mm cultuur.</li>
	<li>Als de gewenste cultuur-systeem in een 96-wells-plaat, plaats van de Bruch membraan explant (1,5 inch in diameter, met gestolde agarose gel) op een vlakke Teflon blad met de laminin-kant omhoog.</li>
	<li>Met behulp van een trephine, gesneden van vijf of zes, 6 mm-cirkelvormige knoppen uit de de Bruch membraan complexe explant en plaats elk op 4% agarose bij 37 ° C in een niet-behandelde polystyreen goed van een 96-wells-plaat. De agarose zal binnen 2-3 minuten bij kamertemperatuur vast van de Bruch membraan explantaten (knoppen) op de bodem van elk putje te stollen. Opmerking: Figuur 2B toont de doorboorde Bruch membraan knoppen in een 96-wells-plaat. Meestal, 9-11 knoppen of explantaten kunnen worden geoogst uit elk van beide ogen.</li>
</ol>3. het kweken van retinale Pigment epitheliale (RPE) cellen in het menselijke Bruch membraan Explants
<ol><li>Na ontvangst van de ogen van de donor, schoon het extraocular weefsel met DPBS. Maak een ze incisie 5 mm onder de iris-sclera aanraken punt (pars plana) in de subretinal ruimte. Gooi het anterieure segment, humor glasvocht en netvlies.</li>
	<li>Wassen van de oogschelp, waarin van de Bruch membraan en RPE blad, met koude DPBS. De RPE cellen met 5 mL trypsine van 0,25% niet langer dan 10 min voor elk oog monster distantiëren. Het doven van de reactie van de trypsine met 25 mL van de volledige medium DMEM met 15% foetale runderserum (FBS) opgewarmd bij 37 ° C in een tube van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 × g gedurende 10 minuten bij 24 ° C en resuspendeer de pellet in 5 mL van DMEM compleet medium (met 15% FBS).</li>
	<li>Cellen tellen en zaad van 15.000 levensvatbare RPE cellen op de basale lamina van elke verschillende leeftijd Bruch membraan explantaten (knoppen) in een 96-wells-plaat in 200 µL van minimale serumvrij essentiële media (MEM) met antibiotica (100 IU/mL penicilline G, 100 mg / mL streptomycine, 5 mg/mL gentamicine en 2,5 mg/mL amfotericine B). Uitgaande van een cel diameter van 20 µm, plating bij deze dichtheid zal toestaan RPE cellen ter dekking van ongeveer 15% van de oppervlakte van de beplating.</li>
	<li>Plaat van de cellen naar de knop, waarbij de celdichtheid kan dan worden verhoogd stapsgewijs omhoog tot 100% samenvloeiing afhankelijk van het effect van elke parameter op het gedrag van de cel.</li>
	<li>Toestaan dat de cellen om te koppelen aan de explant gedurende 24 uur in een bevochtigde sfeer van 95% air/5% CO2 bij 37 ° C. Zachtjes wijzigen medium met warme volledige DMEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Geen van de auteurs hebben commerciële onthullingen aan verklaren.

Leeftijd menselijke Bruch membraan (extracellulaire matrix) draagt bij aan de progressie van de ziekte van AMD en zo is er een noodzaak om te begrijpen hoe deze veranderde matrix bijdraagt tot de RPE cel dysfunctie. Gezien het ontbreken van voldoende dierlijke modellen om te studeren van leeftijd-gerelateerde veranderingen in AMD, kunnen ex vivo de modelsystemen die de gevolgen van de ziekte na te bootsen dienen als een waardevol instrument te begrijpen van de pathofysiologie. De methodologie beschreven in dit manuscript kan worden gebruikt om consequent isoleren menselijke Bruch van membraan explants en cultuur RPE cellen, met inbegrip van de primaire, vereeuwigd of stamcel afkomstige RPE cellijnen.
Zoals eerder vermeld, zijn de menselijke Bruch membraan explantaten afkomstig uit de NDRI. Een protocol is vastgesteld met NDRI waarmee de criteria voor de donor ogen aanvaardbaar. Bijvoorbeeld, donoren moet geen bekende retinale oogziekten, ogen/globes worden opgehaald binnen 10 uur na dood en globes aankomen in het laboratorium binnen 48u na dood (via overnachting pakket levering op ijs). Opgeven van de juiste leeftijdsbereik en aantal ogen die nodig zijn voor de statistische analyse van de studie, bijv., vijf paren van globes van donoren tussen de leeftijd van 20-49 jaar en vijf paren van de wereld van donoren tussen de leeftijd van 50-89 jaar.
De beschikbaarheid van oog globes varieert, meestal elke maand gemiddeld tien paren van globes beschikbaar. De oog-pakket aankomt met basic, de geïdentificeerde donor informatie: leeftijd, ras, de tijd van de dood, oorzaak van de dood, en korte afgelopen medische geschiedenis (ziekte aanbieding of comorbidities).
Belangrijkst, vereist oogsten menselijke Bruch van membraan explantaten de verwijdering van het anterieure segment van het oog en het glasvocht, waardoor voor de isolatie van de RPE-Bruch membraan-vaatvlies complex. Zodra de de Bruch membraan geïsoleerd is, kunnen RPE cellen worden uitgezaaid naar de Acellulair explantaten in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar en gekweekte voor downstream experimenten. De voorbereiding en de procedurele verwerking zoals hierin beschreven is kritisch, met aandacht voor de oriëntatie van de geïsoleerde Bruch membraan om te controleren of het laminaal oppervlak is gerichte-up terwijl het niet aanraken van het oppervlak mechanisch om te voorkomen beschadiging van de oppervlaktestructuur van de extracellulaire matrix.
Ook opgemerkt moet worden dat bij het gebruik van de Bruch membraan explant systemen, zijn er sommige variabelen die invloed kunnen zijn op de resultaten van downstream experimenten zoals individuele donor genomic achtergrond, leeftijd van de de Bruch membraan of postmortem tijd van de de Bruch membraan en de locatie van de de Bruch membraan, dwz., centrale of perifere deel van Bruch van membraan explantaten. Net als bij elke andere menselijke weefsel studie, moet één het passende donor oog monster nummer om de nodige statistische macht en overeenkomen met de donor oog leeftijd eventueel werven. Vaststelling van strikte criteria voor het aanvaarden van de ogen van eye banken is een kritieke parameter. Alleen accepteren ogen die minder dan 10 h postmortem zijn enucleated en die van de Bruch membraan voorbereiding binnen 24-48 h na dood kan worden geoogst. De oogzenuw-site kan worden gebruikt als een marker voor oriëntatie, en gebruik van dezelfde locaties voor experimentele en controlegroepen van de studie. Door deze maatregelen te nemen, kan een experimentele variabiliteit minimaliseren.
In samenvatting, begrip van de RPE-Bruch membraan-vaatvlies complex en hoe het wordt beïnvloed door leeftijd en ziekte is van cruciaal belang voor het begrip van haar bijdrage aan de pathofysiologie van AMD. Modelsystemen waarin ex vivo technieken zijn een waardevol instrument te onderzoeken van deze effecten met behulp van menselijk weefsel. Hierin beschrijven we een methodologie die gebruikmaakt van menselijke donor explantaten als een relevante ex vivo model van leeftijd Bruch van membraan. Deze techniek maakt het mogelijk om het gebruik van leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan als een onderzoeksinstrument om te onderzoeken hoe de structurele veranderingen binnen de matrix kan beïnvloeden bedekken RPE cel gedrag met inbegrip van de bijlage, proliferatie, en gen expressie25 , 27. succesvolle ontwikkeling van soortgelijke ex vivo modelsystemen zal verder van ons begrip van AMD en vergemakkelijken van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties.

Leeftijdsgebonden structurele veranderingen aan de menselijke Bruch membraan, die wordt veroorzaakt door vele factoren, met inbegrip van nitrosative en oxidatieve stress, oefent meerdere schadelijke effecten op de functie van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen en draagt bij aan de pathologie van leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Bij het overwegen van cel substitutietherapie voor geavanceerde atrofische AMD of geografische atrofie, vergt behandeling waarschijnlijk de transplantatie van cellen op een bedje van RPE cel atrofie. Age-gerelateerde veranderingen binnen de menselijke Bruch membraan kunnen nadelig beïnvloeden het succes van getransplanteerde RPE cel transplantaten, gegeven de schade aan de extracellulaire matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. onderzoeken mens Bruch van membraan biologie en hoe structurele veranderingen binnen de matrix aan de progressie naar AMD bijdragen is van vitaal belang voor het begrip van ziekte pathologie. Dus, er is een kritieke behoefte aan de onderzoekers op het gebied van leeftijdsgebonden oog te ontwikkelen van protocollen die beschrijven de ex vivo oogsten van leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan.
Historisch gezien is het moeilijk om model leeftijdsgebonden aandoeningen zoals geografische atrofie en een leeftijd menselijke Bruch membraan in dieren23geweest. Dit probleem vloeit voort uit meerdere factoren zoals de levensduur van de mens ten opzichte van knaagdieren en andere soorten die vaak worden gebruikt voor ziekte modelleren, alsmede het ontbreken van een macula in meeste gewervelde dieren24. Het voordeel van de hier beschreven methode is dat de cellen kunnen worden getest rechtstreeks op de Bruch membraan geëxtraheerd uit postmortem ogen van leeftijd en/of zieke personen. Het algemene doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde methodologie voor een ex vivo model van leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan, met inbegrip van de isolatie van de menselijke Bruch membraan explants van menselijke donoren en het zaaien van RPE cellen voor stroomafwaarts experimenten. Dit model kan dienen als een relevante model te onderzoeken van de bijdrage van de extracellulaire matrix schade op RPE cel functie en pathologie20,25,26,27,28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Naast vitaminen en antioxidanten die zijn aanbevolen door de Age-Related Eye Disease Study, is er geen effectieve therapie voor 'droge' of atrofische leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die 90% van de gevallen vertegenwoordigt. Therapieën nodig zijn bedoeld om te vertragen of de ontwikkeling van geografische atrofie (GA) en Bruch van membraan pathologie is een goed begrip van dit proces. Wijzigingen in de menselijke Bruch membraan voorafgaan aan de progressie van AMD door bij te dragen aan de schade van de retinale pigment epitheliale (RPE) cellen. Gezien het ontbreken van voldoende dierlijke modellen om te studeren van AMD, dienen ex vivo modellen van leeftijd menselijke Bruch membraan als een nuttig instrument om te bestuderen het gedrag van RPE cellen uit vereeuwigd en primaire cellijnen evenals RPE lijnen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen cellen (iPSCs). Hier presenteren we een gedetailleerde methode die maakt het mogelijk om te bepalen van de effecten van RPE cel gedrag ontpit op geoogste menselijke Bruch membraan explantaten van menselijke donoren, met inbegrip van de bijlage, apoptosis en proliferatie, mogelijkheid om phagocytize fotoreceptor buitenste segmenten, vaststelling van polariteit en genexpressie. Deze bepaling biedt een ex vivo -model van leeftijd Bruch van membraan te beoordelen van de functionele eigenschappen van RPE cellen bij uitgezaaid op leeftijd/gecompromitteerd extracellulaire matrix.

Wanneer dit protocol wordt correct uitgevoerd, kan men de effecten van leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan op de functie van de cel RPE bepalen door de vaststelling van polariteit en de buitenste bloed retinale barrière, gepolariseerde afscheiding van groeifactoren en cytokines, en fagocytose van fotoreceptor staaf buitenste segmenten.
We hebben gegevens die aantonen het fenotype van een ziekte op leeftijd menselijke Bruch membraan dat gegenereerd. Bijvoorbeeld, leeftijd culturing RPE cellen op van menselijke Bruch membraan explantaten dalingen RPE cel ingrepen (Figuur 3). RPE cellen gekweekt op leeftijd menselijke Bruch membraan vermindert het vermogen van deze cellen om phagocytize rod buitenste segmenten (ROS), een kritische RPE functie (Figuur 4). Bovendien kunnen apoptotic cellen worden geïdentificeerd en vergeleken op deze knop explantaten met behulp van een terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick einde-labeling (TUNEL) vlek zoals beschreven in eerdere werk26. De gevolgen van een ouder en/of zieke mens Bruch van membraan voor RPE cel genexpressie profiel kunnen worden bepaald met behulp van microarray technologie. We hebben aangetoond dat RPE cel genexpressie wanneer gekweekt op menselijke Bruch de membraan van oudere personen in vergelijking met explantaten van jongere personen (Figuur 5)27wordt gewijzigd. Voor statistische analyse, explantaten van ten minste 3-5 menselijke donoren gebruikt per groep.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figuur 1. Schematische weergave van het isolement van de menselijke Bruch membraan van donor ogen. De menselijke Bruch membranen zijn geoogst door het verwijderen van de sclera anterieure segment, netvlies, glasvocht en inheemse retinale pigment cellen met epitheliale (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figuur 2. Geïsoleerde menselijke Bruch van membraan (BM) in een cultuur schotel. (A) schematische voorstelling van de menselijke Bruch membraan explantaten (elke 1,5 inch in diameter, met gestolde agarose gel) geplaatst in een 60 × 15 mm polystyreen cel cultuur schotel (BM gezicht-omhoog) gevuld met warme vloeibare agarose aan de onderkant van de schotel. (B) een menselijke Bruch membraan explant, die heeft zijn doorboorde in een paar 6 mm ronde knoppen (explantaten), elke ow die werd vervolgens geplaatst op 4% agarose bij 37 ° C in een niet-behandelde polystyreen goed van een 96-wells-plaat. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figuur 3. Retinale pigment epitheliale (RPE) cel ingrepen tarief op jonge en oudere menselijke Bruch membraan (BM). Primaire RPE cellen werden zaadjes op mens Bruch van membraan explants van jonge (< 50-jarige, n = 3) of oudere (> 70-jarige, n = 5) donor ogen voor drie weken. Cel bijlage snelheid werd gemeten door MTT cel levensvatbaarheid assay. Oudere mens Bruch membranen verlaagd de RPE cel bijlage met 24% (jonge BM 100 +/-8.54 S.E. vs. oudere BM 76.65 +/-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = standaardafwijking.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figuur 4. Retinale pigment epitheliale (RPE) cel fagocytose wordt beïnvloed door de leeftijd van de menselijke Bruch membraan (BM). Primaire RPE cellen gekweekt op oudere mens Bruch van membraan explants had een beperkte mogelijkheid om te phagocytize rod buitenste segmenten (ROS) (jonge BM 873 +/-9.3 S.E., n = 5 vs. oudere BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = standaardafwijking.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figuur 5. Aantal retinale pigment epitheliale (RPE) cel genen uitgedrukt in elk monster gekweekt op jonge of oudere menselijke Bruch membraan explants. Er was meer spreiding in het aantal genen uitgedrukt in primaire RPE cellen ontpit op oudere versus jongere menselijke Bruch membraan (6201 ± 388 vs. 6439 ± 80, respectievelijk); vijf explantaten werden getest voor elke leeftijdsgroep. Gepresenteerd met de volledige toestemming van alle auteurs van Cai, H et al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Het doel van dit protocol is om aan te tonen dat het kweken van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen op leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan. Deze methode is geschikt om te bestuderen het gedrag van de cel van de RPE op een gecompromitteerde extracellulaire matrix.

Kweken van de epitheliale cellen van de retinale Pigment op een Ex Vivo Model van leeftijd menselijke Bruch membraan

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Geoptimaliseerd<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Het kweken van kippenembryo&#39;s tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Oprichting van een klinisch relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...