Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

이 연구는 망막 퇴행 성 질병 기초 싸우는 장 님에 대 한 방지 실명, 뉴욕, www.rpbusa.org, 및 더 큰 뉴욕 센터 연구에 의해 지원 됩니다 www.blindness.org. 저자는 Luanna 바르 톨 로메 오, 박사,이 원고에의 그녀의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다.

다음 프로토콜은 헬싱키의 선언 및 예일 대학 인간 연구 윤리 위원회 지침의 신조를 준수에서 수행 됩니다.
1. 인간 기증자 눈 소싱
<ol><li>국가 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, 펜 실바 니 아)에서 인간 기증자 글로브를 얻습니다. 프로젝트에 따라 각 실험 그룹 기증자 눈의 이상 3 쌍을 준비 합니다.</li>
	<li>10 h 이내 기증자 눈 및 48 h 사후내 배 enucleate. 그런 다음 눈 살 균 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 문화 매체 얼음에 있는 실험실을 전송 합니다. 이전 보고 연구 기증자 눈 수확 및 생물 학적 기능 및 Bruch의 막25,,2629의 활동이 패션 보존에 이송 증명 하고있다.</li>
</ol>2. 인간의 Bruch 막의 수확 Explants
<ol><li>1.5 x 1.5 인치 거 즈에 각 눈 적셔 100mm 문화 접시에 후부는 limbus sclera 3mm 통해 절 개를 만들기 위해 사용 잘 블레이드가 위 이산화탄소 독립적인 DMEM 미디어와 원주 어느 방향으로 확장 하는 장소.</li>
	<li>확인 또는 참나무에 전체 두께 원주 절 개 (유리를 관통) 1mm 후부. 제거 하 고 이전 세그먼트 (각 막, 렌즈, 및 홍 채), 유리 체 및 망막을 삭제.</li>
	<li>미세 수술가 위 공 막 엔, 맥락 막, 사이 4 개의 방사형 절 개를 사용 하 여 하 고을 피하기 위해 복잡 한 맥락 막/Bruch 막 끊어지고 돌보는 동안 시 신경에 주변에서 공 막 엔 껍질.</li>
	<li>다음, ora 참나무 따라 suprachoroidal 공간을 통해 완곡 한 절 개를 확인 하 고는 sclera에서 뒤로 RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한 껍질.</li>
	<li>0.02 M Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 DPBS (그림 1)에서 3 시간을 세척 하 여 다음 실 온에서 20 분 페 트리 접시에에서 수산화 암모늄을 explant 목욕 여 네이티브 RPE 세포를 제거 합니다.</li>
	<li>Unlaminated, 소수 성 65 µ m 두께 소계 막 막 직면 각 explant의 기저 lamina 레이어와 0.2 µ m 숨 구멍을 통해 이산화 탄소 자유로운 매체에 Bruch의 막 복잡 한 explant 부동.</li>
	<li>유리 microanalysis 진공 필터 홀더 시스템에 Bruch의 막 explant와 소계 막을 유리 fritted 지원에 놓습니다.</li>
	<li>미세 집게를 Bruch의 막 기저 laminin 측면을 건드리지 않도록 돌보는 테플론으로 코팅을 안 쪽에서 컬된 가장자리를 평평.</li>
	<li>Agarose DPBS (4%)의 15 mL를 열 및 다음 37 ° c 냉각 그럼는 explant 평면 유지 됩니다 보장 하기 위해 부드러운 흡입을 적용 하는 동안 안 쪽에서 Bruch의 막-맥락 막의 복잡 한에 liquidized 젤의 15 mL를 붓는 다. 2-3 분 하는 agarose를 공고히 하 고 다음 소계 막 떨어져 껍질 4 ° C에서 조직 유지.</li>
	<li>Bruch의 막 explant (응고 agarose 젤에서 직경에 있는 1.5 인치) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 셀 문화 접시에 (Bruch의 막 위로 향하도록)으로 늘어서 되었습니다 따뜻한 액체 agarose Bruch의 멤브레인을 해결 하기 위해 접시의 하단에 있는 장소 향하도록 explant 기저 laminin 레이어와 explant 우물의 바닥에.</li>
	<li>agarose Bruch의 막 explants 문화 접시에 안정화를 위해 상 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. Bruch의 막 문화에서 explants 커버 DPBS와 접시와 미래 사용을 위한 4 ° C에서 접시를 저장 합니다. 그림 2A 격리 Bruch 막 explants는 60 x 15 m m 문화 접시에 보여 줍니다.</li>
	<li>96 잘 접시에 원하는 문화 시스템 있으면 최대 Bruch의 막 explant (1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤) laminin 사이드와 평면 테 플 론 시트에 놓습니다.</li>
	<li>5 또는 6, 인하는 판형을 사용 하 여 복잡 한 Bruch의 막에서 6 mm 원형 버튼 explant 고 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 각각 4 %agarose 장소. agarose 각 우물의 바닥에 Bruch의 막 explants (버튼)를 해결 하기 위해 실 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. 참고: 그림 2B 는 96 잘 접시 trephined Bruch 막 단추를 보여 줍니다. 일반적으로 9-11 단추 또는 explants 각 눈에서 수확 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 인간의 Bruch 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 배양 Explants
<ol><li>기증자 눈을 접수 한 후, 청소와 DPBS extraocular 조직. 완곡 한 절 개를 아이리스 sclera 아래 5mm subretinal 공간에 포인트 (동위 플) 터치를 확인 합니다. 이전 세그먼트, 유리 체 및 망막을 삭제 합니다.</li>
	<li>Bruch의 막과 차가운 DPBS RPE 시트 포함 아이피 워시. 각 눈 샘플 10 분 보다는 더 이상에 대 한 0.25 %trypsin 5 mL와 RPE 세포 분열 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 50 mL 튜브에 37 ° C에서 예 열 된 DMEM 완전 한 매체의 25 mL로 trypsin 반응을 끄다.</li>
	<li>24 ° C에서 10 분 동안 200 × g에서 세포를 원심과 DMEM 완전 한 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (15 %FBS).</li>
	<li>셀을 계산 하 고 각 다양 한 세 Bruch 막 explants (버튼) 혈 청 무료 최소 필수 미디어 (MEM)의 200 µ L에서 96 잘 접시에 항생제를 포함의 기저 lamina 에 15000 가능한 RPE 세포 씨앗 (100 IU/mL 페니실린 G, 100 mg / mL 스, 5 mg/mL gentamicin, 그리고 2.5 mg/mL 암포 B). 가정 셀 직경 20 µ m,이 밀도에서 도금의 도금 면적의 약 15%를 커버 하는 RPE 세포 수 있습니다.</li>
	<li>그것에 의하여 셀 밀도 수 있습니다 다음까지 증가 시킬 stepwise 셀 동작에 각 매개 변수의 영향에 따라 100% 합류 하는 버튼에 셀 접시</li>
	<li>37 ° c.에 95% air/5% CO2 의 습도 분위기에서 24 h explant 연결할 셀 허용 부드럽게 따뜻한 완벽 한 DMEM과 매체를 변경 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

작가의 아무도 어떤 상업적인 공개 선언 하 있다.

세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.
앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 예의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.
눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.
가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.
또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 즉의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.
요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식25 셀 동작 , 27. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.

나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리 . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.
역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물23세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추24에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리20,25,26,,2728에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, "건조" 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.

이 프로토콜 제대로 수행 되 면 하나 극성 및 외부 혈액 망막 방 벽의 설립, 성장 인자, cytokines의 편광된 분 비에 의해 RPE 세포 기능에 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 확인할 수 있습니다. 그리고 포토 리셉터 막대 외부 세그먼트의 식 균 작용입니다.
우리 세 인간의 Bruch 막에 질병 표현 형을 설명 하는 데이터를 생성 했습니다. 예를 들어 인간의 Bruch 막 explants 감소 RPE 세포 뚝 (그림 3) 세에 RPE 세포 배양. 세 인간의 Bruch 막에 경작 하는 RPE 세포 감소 수 이러한 세포의 phagocytize 막대 외부 세그먼트 (선생님), RPE는 중요 한 기능 (그림 4). 또한, apoptotic 세포 확인 하 고 이전 작업26에 설명 된 대로 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 얼룩을 사용 하 여 이러한 버튼 explants에 비교 될 수 있습니다. RPE 세포 유전자 표현 프로 파일에는 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 microarray 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 젊은 개인 (그림 5)27explants에 비해 더 오래 된 개인에서 인간의 Bruch 막에 경작 하는 경우 RPE 세포 유전자 발현 변경 설명 했다. 통계 분석을 위해 적어도 3-5 인간 기증자에서 explants는 그룹 당 사용 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> 그림 1입니다. 기증자 눈에서 인간의 Bruch 막의 절연의 도식 대표. 인간의 Bruch 막 sclera, 앞쪽 세그먼트, 망막, 유리 체, 제거 하 여 수확 하 고 네이티브 망막 안료 상피 (RPE) 세포. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 Bruch 막 (BM) 문화 접시에 절연. (A) 인간의 Bruch 막 explants (각 1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤)의 회로도에 배치 60 × 15 mm 폴리스 티 렌 셀 문화 접시 (BM 보여지는) 접시의 하단에 따뜻한 액체 agarose로 가득. 몇 가지 6mm 원형 단추 (explants)에 trephined은 (B)는 인간의 Bruch 막 explant 각 유량을 다음에 배치 되었다 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 4 %agarose. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> 그림 3입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 젊고 더 오래 된 인간의 Bruch 막 (BM)에 뚝 속도. 기본 RPE 세포 인간 Bruch의 막 영에서 explants에 시드 했다 (< 50 세, n = 3) 이상 (> 70 세, n = 5) 3 주 동안 기증자 눈. 세포 부착 속도 MTT 세포 생존 능력 분석 실험에 의해 측정 되었다. 더 오래 된 인간의 Bruch 막 RPE 세포 부착 속도 24% 감소 (젊은 BM 100 8.54 + 1.44 + 이전 BM 76.65 대 남동 남동). p < 0.05, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> 그림 4입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 먹어서 인간의 Bruch 막 (BM)의 나이 의해 영향을 받습니다. 기본 RPE 세포 이전 인간 Bruch의 막 explants에 경작 했다 감소 수 막대 외부 세그먼트 (선생님) phagocytize (9.3 + 젊은 BM 873 남동, n = 25.4 + 이전 BM 608 대 5 남동, n = 5). p < 0.01, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> 그림 5입니다. 수가 망막 안료 상피 (RPE) 셀 유전자 영에 경작 하는 각 샘플에 표현 또는 이전 인간의 Bruch 막 explants. 거기에 시드 기본 RPE 세포에 표현 된 유전자의 수에 더 많은 피해를 했다 젊은 인간의 Bruch 막 대 이전 (6201 ± 388 6439 ± 80, 대 각각); 5 explants는 각 연령 그룹에 대 한 테스트 되었습니다. Cai의 모든 작가의 전체 권한 함께 제시 H 외. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

최적화<em&gt; 전 비켜</em&gt; 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

연구

발생학

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 VIVO</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...