Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Denne forskningen støttes av forskning for å hindre blindhet, New York, www.rpbusa.org og Greater New York Center for Retinal Degenerative sykdom Foundation Fighting blindhet, www.blindness.org. Forfatterne vil gjerne takke Luanna Bartholomew, Ph.D., for hennes kritisk gjennomgang av dette manuskriptet.

Følgende protokollen utføres i tilslutning til prinsippene for deklarasjon i Helsinki og Yale University menneskelige forskning etikk retningslinjene.
1. sourcing menneskelige Donor øyne
<ol><li>Få menneskelige donor globes fra den nasjonale sykdom forskning Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Forberede ikke mindre enn tre par donor øynene hver forsøksgruppen avhengig av prosjektet.</li>
	<li>Enucleate giver øyne innen 10 h og skipet innen 48 timer post mortem. Deretter transportere øynene til laboratoriet i sterilt Dulbecco endret Eagle medium (DMEM) kultur medium på is. Tidligere har rapporterte studier vist at donor øyne høstes og transportert i dette mote bevare det biologiske egenskaper og aktiviteter Bruchs membran25,26,29.</li>
</ol>2. høsting av menneskelig Bruch membran Explants
<ol><li>Plasser hvert øye på en 1,5 x 1,5 tommers gasbind fuktet med karbondioksid-uavhengig DMEM media i en 100 mm kultur parabol, og bruk fint blad saks å gjøre et snitt gjennom sclera 3 mm bakenfor limbus og circumferentially utvide i begge retninger.</li>
	<li>Lage en full-tykkelse omkrets snitt (penetrating til linsen) 1 mm posterior til ora-serrata. Fjerne og slette anterior segment (hornhinnen, objektiv og iris) glasslegemet og netthinnen.</li>
	<li>Bruk fint kirurgisk saks for å gjøre fire radial snitt mellom sclera og akkord, og deretter skallet sclera fra periferien av synsnerven, mens du tar vare å unngå rive akkord/Bruchs membran komplekse.</li>
	<li>Deretter lage en omkrets snitt gjennom suprachoroidal plass langs ora serrata og Skrell RPE-Bruchs membran-akkord komplekse posteriorly fra sclera.</li>
	<li>Fjerne innfødt RPE celler av bading explant med 0.02 M ammonium hydroxide i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) i en 60 x 15 mm isopor Petriskål for 20 min i romtemperatur, etterfulgt av vaske den tre ganger i DPBS (figur 1).</li>
	<li>Flyt Bruchs membran komplekse explant i karbondioksid-frie medier over et unlaminated, hydrofobe 65 µm tykke polytetrafluoroethylene membran med 0,2 µm porene, med basale lamina laget av hver explant overfor membranen.</li>
	<li>Plass en polytetrafluoroethylene membran med Bruchs membran explant på en fritted glass støtte i et glass microanalysis vakuum filterholderen system.</li>
	<li>Flat krøllet kantene fra choroidal siden med fine tang belagt med Teflon, ta vare ikke for å berøre Bruchs membran basale laminin side.</li>
	<li>Varme 15 mL agarose (4% i DPBS) og deretter avkjøles den til 37 ° C. Så helle 15 mL liquidized gel på Bruchs membran-akkord komplekse fra choroidal-side mens du bruker skånsom for å garantere at explant vil forbli flat. Hold vev på 4 ° C i 2-3 minutter å stivne i agarose og deretter skallet polytetrafluoroethylene membranen bort.</li>
	<li>Plass Bruchs membran explant (1,5 inches i diameter, innen befestet agarose gel) i en 60 x 15 mm polystyren celle kultur rett (med Bruchs membran opp.) som har blitt foret med varm væske agarose på bunnen av parabolen fikse Bruchs membran explant på bunnen av brønnen med explant basale laminin laget grossist.</li>
	<li>Agarose stivner innen 2-3 min ved romtemperatur å stabilisere Bruchs membran explants i kultur parabolen. Dekke Bruchs membran explants i kultur parabol med DPBS og lagre retten på 4 ° C for fremtidig bruk. Figur 2A demonstrerer isolert Bruchs membran explants i en 60 x 15 mm kultur parabol.</li>
	<li>Hvis det ønskede kultur-systemet i en 96-brønns plate, plass Bruchs membran explant (1,5 inches i diameter, med befestet agarose gel) på et flatt Teflon ark med laminin-side opp.</li>
	<li>Bruker en trephine, kuttet fem eller seks, 6 mm-sirkulært knappene fra Bruchs membran komplekse explant og plassere hver på 4% agarose på 37 ° C i en ikke-behandlet isopor godt av en 96-brønns plate. Agarose stivner innen 2-3 min ved romtemperatur å fikse Bruchs membran explants (knapper) på bunnen av hver brønn. Merk: Figur 2B demonstrerer trephined Bruch membran knapper i en 96-brønns plate. Vanligvis kan 9-11 knapper eller explants høstes fra hvert øye.</li>
</ol>3. dyrking av netthinnens Pigment epiteliale (RPE) celler på menneskelig Bruch membran Explants
<ol><li>Ved mottak av donor øynene, rense extraocular vev med DPBS. Gjøre en omkrets snitt 5 mm under iris-sclera touch punkt (pars plana) i subretinal plass. Kast i anterior segment, glassporselen humor og netthinnen.</li>
	<li>Vask eyecup, som inneholder Bruchs membranen og RPE ark, med kalde DPBS. Distansere RPE cellene med 5 mL 0,25% trypsin lenger enn 10 min for hver øye prøve. Slukke trypsin reaksjon med 25 mL DMEM komplett medium med 15% fosterets bovin serum (FBS) varmet på 37 ° C i en 50 mL tube.</li>
	<li>Sentrifuge cellene på 200 × g i 10 min på 24 ° C, og resuspend pellet i 5 mL av DMEM komplett medium (med 15% FBS).</li>
	<li>Telle celler og frø 15.000 levedyktig RPE celler på basale lamina av hver ulike alderen Bruchs membran explants (knapper) i en 96-brønns plate i 200 µL av serum-free minimum viktige medier (MEM) som inneholder antibiotika (100 IU/mL penicillin G, 100 mg / mL streptomycin, 5 mg/mL gentamicin og 2,5 mg/mL amfotericin B). Forutsatt en celle diameter på 20 µm, plating på denne tetthet kan RPE cellene dekker ca 15% av området plating.</li>
	<li>Plate cellene på knappen, der cellen tetthet kan deretter økes trinnvis opp til 100% samløpet avhengig av effekten av hver parameter på cellen atferd.</li>
	<li>At cellene å knytte til explant 24 h i et fuktet 95% air/5% CO2 på 37 ° C. Forsiktig endre medium med varm fullstendig DMEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Ingen av forfatterne har noen kommersiell avsløringer å erklære.

Alderen menneskelige Bruchs membran (ekstracellulær matrix) bidrar til sykdomsprogresjon av AMD, og dermed er det behov for å forstå hvordan denne endrede matrise bidrar til RPE celle dysfunksjon. Gitt mangelen på tilstrekkelig dyremodeller å studere alder-relaterte endringer i AMD, kan ex vivo modellsystemer som etterligner effekten av sykdom tjene som et verdifullt verktøy for å forstå patofysiologien. Metodikk beskrevet i dette manuskriptet kan brukes konsekvent isolere menneskelige Bruchs membran explants og kultur RPE cellene, inkludert primær, udødeliggjort eller Stamcelle-avledet RPE linjer.
Som nevnt tidligere, er menneskelige Bruch membran explants Hentet fra NDRI. En protokoll er etablert med NDRI som angir kriteriene som er angitt for donor øyne å være akseptabelt. For eksempel givere må har ingen kjente retinal øyesykdommer, øyne/Globe hentes innen 10 timer etter døden og globuser kommer i laboratoriet innen 48 timer etter død (via levering over natten pakken på is). Angir passende aldersgruppe og antall øyne nødvendig for statistisk analyse av studien, f.eks., fem par Globes fra givere mellom 20-49 år og fem verden par fra givere mellom 50-89 år.
Øye Globes varierer, vanligvis gjennomsnitt ti par Globes tilgjengelig hver måned. Øye pakken kommer med grunnleggende, de identifiserte giverinformasjon: alder, rase, dødstidspunktet, dødsårsaken, og korte tidligere medisinsk historie (sykdom liste eller samtidige).
Viktigst, krever høsting menneskelige Bruch membran explants fjerning av anterior segment av øyet og linsen, slik at isolering av RPE-Bruchs membran-akkord komplekset. Når Bruchs membranen er isolert, kan RPE celler seeded på acellular explants i ulike konsentrasjoner og kultivert for nedstrøms eksperimenter. Forberedelse og fremgangsmåter for håndtering dette er kritisk, betaler oppmerksomhet til retningen til isolerte Bruchs membran sørge laminal overflaten er vendt opp stund ikke berørende overflaten mekanisk for å unngå skade på ekstracellulær matrix overflaten struktur.
Det bør også bemerkes at ved Bruchs membran explant systemer, finnes det noen variabler som kan påvirke resultatene av nedstrøms eksperimenter som individuelle donor genomisk bakgrunnsfarge, alder av Bruchs membran eller postmortem tid for Bruchs membran, og plasseringen av Bruchs membran, dvs., sentral eller ekstern del av Bruchs membran explants. Som med alle andre menneskelig vev studien, må en rekruttere hvor passende donor øye utvalg har nødvendig statistiske makt og matche donor øye alder hvis aktuelt. Etablere strenge kriterier for å akseptere øyne fra øye banker er en viktig parameter. Bare godta øyne som er enucleated mindre enn 10 h postmortem og Bruchs membran forberedelse kan høstes innen 24-48 timer etter døden. Synsnerven nettstedet kan brukes som en markør for retning, og bruke de samme stedene for eksperimentelle og kontroll kollokvier. Ved å ta disse tiltakene, kan en minimere eksperimentell variasjoner.
I sammendraget er forståelse av RPE-Bruchs membran-akkord kompleks og hvordan den påvirkes av alder og sykdom avgjørende for å forstå sitt bidrag i patofysiologien av AMD. Modellsystemer det ansette ex vivo teknikker er et verdifullt verktøy for å undersøke effektene ved hjelp av menneskelig vev. Her, beskriver vi en metode som sysselsetter menneskelige donor explants som relevante ex vivo modell av alderen Bruch membran. Denne teknikken gjør det mulig å bruke alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran som et forskningsverktøy for å undersøke hvordan strukturelle endringer innenfor matrise kan påvirke overliggende RPE celle atferd inkludert vedlegg, spredning og gene expression25 , 27. vellykkede utviklingen av lignende ex vivo modellsystemer vil ytterligere vår forståelse av AMD og Letter utviklingen av romanen behandlingsalternativer.

Age-relaterte strukturelle endringer i menneskelig Bruch membran, som er forårsaket av mange faktorer, inkludert nitrosative og oksidativt stress, har flere skadelige effekter på funksjon av netthinnens pigment epiteliale (RPE) celler og bidrar til den patologi av aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Når cellen erstatning terapi for avansert atrofier AMD eller geografiske atrofi, vil behandling trolig kreve transplantasjon av celler på en seng av RPE celle atrofi. Alder-relaterte endringer i menneskelig Bruch membranen kan påvirke suksessen av transplantert RPE celle grafts, skadene ekstracellulær matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. gransker menneskelige Bruchs membran biologi og hvordan strukturelle endringer innenfor matrise bidra til fremdriften til AMD er avgjørende for å forstå sykdom patologi. Dermed er det et kritisk behov for etterforskerne i feltet aldersrelatert øye å utvikle som beskriver ex vivo høsting av alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran.
Historisk har det vært vanskelig å modell aldersrelaterte lidelser som geografisk atrofi og en alderen menneskelige Bruchs membran i dyr23. Dette problemer oppstår fra flere faktorer, inkludert levetiden av Human sammenlignet gnagere og andre arter brukte for sykdom modellering, samt mangel på en macula i de fleste virveldyr24. Fordelen av metoden beskrevet her er at cellene kan testes direkte på Bruchs membran utvunnet fra post mortem øyne alderen og/eller syke individer. Det overordnede målet med denne artikkelen er å gi en detaljert metodikk for en ex vivo modell av alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran, inkludert isolering av menneskelig Bruch membran explants fra menneskelige givere og såing av RPE celler for nedstrøms eksperimenter. Denne modellen kan tjene som en relevant modell å undersøke bidrag av ekstracellulær matrix skader på RPE celle funksjon og patologi20,25,26,27,28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Bortsett fra vitaminer og antioksidanter anbefalt av Age-Related Eye Disease Study, er det ingen effektiv terapi for "tørr", eller atrofier age-makuladegenerasjon (AMD) som representerer 90% av tilfellene. Behandling er nødvendig for å bremse eller retard utviklingen av geografiske atrofi (GA), og forstå Bruchs membran patologi er del av denne prosessen. Endringer i menneskelig Bruch membran foran progresjon av AMD ved å bidra til skade av netthinnens pigment epiteliale (RPE) celler. Gitt mangelen på tilstrekkelig dyremodeller å studere AMD, tjene ex vivo modeller av alderen menneskelige Bruchs membran som en nyttig verktøyet å studere atferden til RPE celler fra udødeliggjort og primære cellelinjer samt RPE linjene avledet fra indusert pluripotent stilk celler (iPSCs). Her presenterer vi en detaljert metode som gjør det mulig å fastslå effekten av RPE celle atferd seeded på høstet menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige givere, inkludert vedlegg, apoptose og spredning, muligheten til å phagocytize photoreceptor ytre segmenter, etablering av polaritet og genuttrykk. Denne analysen gir en ex vivo modell av alderen Bruch membran å vurdere funksjonelle egenskaper av RPE celler når seeded på alderen/kompromittert ekstracellulær matrix.

Når denne protokollen utføres riktig, kan en bestemme effekten av alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran på RPE celle-funksjonen ved etableringen av polaritet og ytre blod retinal barrieren, polariserte sekresjon av vekstfaktorer og cytokiner, og fagocytose photoreceptor stang ytre segmenter.
Vi har generert data som viser en sykdom fenotypen på alderen menneskelige Bruchs membran. For eksempel alderen dyrking RPE celler på menneskelige Bruch membran explants minsker RPE celle reattachment (Figur 3). RPE celler kultivert på alderen menneskelige Bruchs membran reduserer kapasiteten til disse cellene for phagocytize stang ytre segmenter (ROS), en viktig RPE funksjon (Figur 4). Videre kan apoptotisk celler identifiseres og sammenlignet på disse knapp explants med en terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick slutten-merking (tunnel) flekk som beskrevet i tidligere arbeid26. Effekten av en gammel og/eller syke menneskelige Bruchs membran RPE celle gene expression profilen kan bestemmes microarray teknologi. Vi har vist at RPE celle genuttrykk endres når kultivert på menneskelig Bruch membran fra eldre personer sammenlignet med explants fra yngre enkeltpersoner (figur 5)27. Statistisk analyse brukes explants fra minst 3-5 menneskelige givere per gruppe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figur 1. Skjematisk fremstilling av isolering av menneskelig Bruch membran fra donor øyne. Menneskelige Bruch membraner høstes ved å fjerne sclera, anterior segment, netthinnen, glassporselen, og innfødt retinal pigment epitelceller (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figur 2. Isolert menneskelige Bruch membran (BM) i en kultur parabol. (A) skjematisk av menneskelig Bruch membran explants (hver 1,5 inches i diameter, med befestet agarose gel) plassert i en 60 × 15 mm polystyren celle kultur parabol (BM forside opp) fylt med varm væske agarose på bunnen av parabolen. (B) en menneskelig Bruch membran explant som har vært trephined i noen 6 mm runde knapper (explants), hver ow som ble så plassert på 4% agarose på 37 ° C i en ikke-behandlet isopor godt av en 96-brønns plate. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figur 3. Netthinnens pigment epiteliale (RPE) celle reattachment rate på unge og eldre menneskelige Bruchs membran (BM). Primære RPE celler var frø på menneskelige Bruchs membran explants fra young (< 50 år gamle, n = 3) eller eldre (> 70 år gammel, n = 5) donor øyne for tre uker. Vedlegg cellehastighet ble målt ved MTT celle levedyktighet analysen. Eldre menneskelige Bruchs membraner redusert RPE cellehastighet-vedlegg med 24% (unge BM 100 +/-8.54 S.E. vs eldre BM 76.65 +/-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = standardfeil.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figur 4. Netthinnens pigment epiteliale (RPE) cellen fagocytose påvirkes alder av menneskelig Bruchs membran (BM). Primære RPE cellene kultivert på eldre menneske Bruchs membran explants hadde en redusert evne til å phagocytize stang ytre segmenter (ROS) (unge BM 873 +/-9.3 S.E., n = 5 vs eldre BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = standardfeil.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figur 5. Antall retinal pigment epiteliale (RPE) cellen gener i hver prøve kultivert unge eller eldre menneskelige Bruchs membran explants. Det var flere scatter av gener som er uttrykt i primære RPE celler seeded på eldre mot yngre menneskelige Bruchs membran (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, henholdsvis); fem explants ble testet for hver aldersgruppe. Presentert med full tillatelse fra alle forfatterne av Cai, H et al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Målet med denne protokollen er å vise dyrking av netthinnens pigment (RPE) epitelceller på alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran. Denne metoden er egnet til å studere RPE celle atferd på en kompromittert ekstracellulær matrix.

Dyrking av netthinnens Pigment epitelceller på en Ex Vivo modell av alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimalisert<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrking av Chick embryoer til avanserte stadier av utvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Utledning av retinal pigment epitelet Celler fra stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Stammer Netthinne Pigment Epitel (RPE) fra Induced pluripotent Stem (IPS) Cells av forskjellige størrelser av embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering av en klinisk relevant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modell for Gransker Epithelial Wound Reparasjon i Native mikromiljøet

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

I Vivo Sporing av menneskelig liggende under Adipose-avledet Mesenchymal stamceller i en rotte kneet slitasjegikt modell med fluorescerende lipofile membran fargestoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering transplantasjon-passer netthinnens Pigment epitel vev avledet fra menneskelige embryonale stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...