Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Это исследование поддерживается исследования, чтобы предотвратить слепоту, Нью-Йорк, www.rpbusa.org и центр большого Нью-Йорка для сетчатки дегенеративные болезни фонд борьбы слепота, www.blindness.org. Авторы хотели бы поблагодарить Luanna Бартоломью, Ph.D., за ее критический обзор этой рукописи.

Следующий протокол выполняется в приверженности принципам Хельсинкской декларации и руководящих принципов, Йельский университет человека Комитет по этике исследований.
1. Поиск доноров человеческого глаза
<ol><li>Получите глобус человека доноров от национального болезни исследования обмена (НДРИ, Филадельфия, PA). В зависимости от проекта подготовить не менее чем три пары глаз доноров для каждой экспериментальной группы.</li>
	<li>Enucleate глаза доноров в течение 10 ч и корабль в течение 48 ч после смерти. Затем транспорт глаза в лабораторию в стерильных Дульбекко модифицированных Eagle среднего (DMEM) питательной среды на льду. Ранее сообщалось исследования показали, что доноров глаза собирают и транспортируется в этой моде заповедник биологические особенности и деятельности Бруха мембраны25,26,29.</li>
</ol>2. заготовка мембраны Бруха человека эксплантах
<ol><li>Место каждого глаза на 1,5 x 1,5 дюймовый марлей, смоченной двуокиси углерода независимые СМИ DMEM в 100 мм культуры блюдо и использование изящный клинок ножницы сделать надрез через склера 3 мм кзади лимба и окружности расширения в любом направлении.</li>
	<li>Сделать полный толщина продольных разреза (проникая в стекловидное тело) 1 мм кзади до Ора Серрата. Снимите и выбросьте переднего сегмента (роговицы, хрусталика и Ирис), стекловидного тела и сетчатки.</li>
	<li>Использование тонкой Ножницы хирургические сделать четыре радиального разреза между склерой и сосудистое и затем кожуру склеры от периферии к зрительному нерву, заботясь чтобы избежать разрывов Хориоидея/Бруха мембраны комплекс.</li>
	<li>Далее сделать продольных разрез через suprachoroidal пространство вдоль Серрата Ора и корки ПЭС-Бруха мембраны Хориоидея комплекс кзади от склеры.</li>
	<li>Удалите родной НПП клетки, купание экспланта с 0,02 М Гидроксид аммония в Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) на 60 x 15 мм пенополистирола Петри для 20 мин при комнатной температуре, после мытья его 3 - раза в DPBS (рис. 1).</li>
	<li>Плавать экспланта комплекс мембраны Бруха в двуокись углерода свободных СМИ над unlaminated, гидрофобные 65 мкм толщиной политетрафторэтилена мембраны с 0,2 мкм поры, с базальной пластинки слоем каждый экспланта сталкивается мембраны.</li>
	<li>Место политетрафторэтилена мембраны с экспланта мембраны Бруха на поддержку фриттированных стекла в системе вакуумного фильтра держатель стекла микроанализа.</li>
	<li>Придавить завернутыми краями от хориоидеи стороны с тонкой щипцами, покрытые тефлоном, стараясь не коснуться стороны базальной Ламинин мембраны Бруха.</li>
	<li>Тепла 15 мл агарозы (4% в DPBS) и затем охладить до 37 ° C. Затем залейте 15 мл liquidized геля на комплекс мембраны-сосудистая оболочка Бруха от хориоидеи стороны при применении нежный всасывания, чтобы гарантировать, что экспланта останется плоской. Держите ткани на 4 ° C на 2-3 минут, чтобы затвердеть агарозы и затем очистить политетрафторэтилена мембраны прочь.</li>
	<li>Место экспланта мембраны Бруха (1,5 дюйма в диаметре, в пределах затвердевших агарозном геле) в 60 x 15 мм полистирола клетки культуры блюдо (с мембраны Бруха вверх) который был выстроились с теплой жидкой агарозы в нижней части блюда, чтобы исправить мембраны Бруха explant в нижней части скважины с слой базальный Ламинин экспланта вверх.</li>
	<li>В течение 2-3 мин при комнатной температуре для стабилизации эксплантов мембраны Бруха в культуре блюдо будет закрепить агарозы. Покрытие мембраны Бруха эксплантах в культуре блюдо с DPBS и хранить блюдо на 4 ° C для использования в будущем. Рисунок 2A демонстрирует, что мембрана Бруха-изолированные эксплантах в культуре блюдо 60 x 15 мм.</li>
	<li>Если желаемый культуры система находится в 96-луночных плита, место экспланта мембраны Бруха (1,5 дюйма в диаметре, с затвердевшей агарозном геле) на плоский лист тефлон с Ламинин стороной вверх.</li>
	<li>С помощью трепанации, вырежьте пять или шесть, 6 кнопок мм циркуляр от мембраны Бруха, комплекс explant и место каждый на 4% агарозном при 37 ° C в не лечение полистирол о 96-луночных пластины хорошо. Агарозы будет затвердеть в течение 2-3 мин при комнатной температуре, чтобы исправить эксплантов мембраны Бруха (кнопки) в нижней части каждой скважины. Примечание: Рисунок 2B демонстрирует trephined Бруха Мембранные кнопки в 96-луночных пластине. Как правило 9-11 кнопок или эксплантов могут быть собраны из каждого глаза.</li>
</ol>3. Культивирование клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) на мембране Бруха человека эксплантах
<ol><li>По получении в глазах доноров очистите экстраокулярных ткани с DPBS. Сделайте продольных разреза 5 мм ниже Ирис склера Коснитесь точки (Парс plana) в субретинальное пространство. Отказаться от переднего сегмента, юмора стекловидного тела и сетчатки.</li>
	<li>Вымойте наглазник, который содержит мембраны Бруха и лист НПП, с холодной DPBS. Отделить НПП клетки с 5 мл 0,25% трипсина не более 10 минут для каждого образца, глаз. Утолите трипсина реакции с 25 мл DMEM полной среды с плода бычьим сывороточным 15% (ФБС) нагревают при 37 ° C в 50 мл трубки.</li>
	<li>Центрифуга клетки на 200 g × 10 мин при 24 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл DMEM полного среднего (с 15% FBS).</li>
	<li>Подсчитать количество ячеек и семян 15 000 жизнеспособным НПП клетки на базальной пластинки каждого различных возрасте Бруха мембраны эксплантов (кнопки) в 96-луночных пластины в 200 мкл сыворотки бесплатно минимум основных СМИ (MEM) содержащие антибиотики (пенициллин G 100 МЕ/мл, 100 мг / Мл стрептомицина, гентамицин 5 мг/мл и 2,5 мг/мл амфотерицин B). Предполагая, диаметр ячейки 20 мкм, покрытие на этом плотности позволит НПП клетки, чтобы охватить приблизительно 15% от площади покрытия.</li>
	<li>Пластина клетки на кнопку, которой плотность ячеек можно затем увеличить шагам вверх до впадения 100% в зависимости от влияния каждого параметра на поведение клеток.</li>
	<li>Позволяют клеткам для присоединения к экспланта для 24 h в атмосфере увлажненные 95% air/5% CO2 при 37 ° C. Слегка измените средний с теплой полный DMEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Никто из авторов имеют любые коммерческие раскрытия объявить.

Возрасте человека Бруха мембраны (внеклеточная матрица) способствует прогрессированию заболевания AMD и, таким образом, необходимо понять, как этот измененный матрица способствует НПП клеток дисфункции. Учитывая отсутствие достаточных животных моделей для изучения возрастных изменений в ДРАМАХ, ex vivo модель системы, которые имитируют последствия заболевания может служить ценным инструментом для понимания патофизиологии. Методике, описанной в этой рукописи может использоваться последовательно изолировать человека эксплантах мембраны Бруха и культуры НПП клеток, включая начальное, увековечен или стволовых клеток, полученных НПП клеточных линий.
Как упоминалось ранее, эксплантов мембраны Бруха человека получены из НДРИ. Протокол устанавливается с НДРИ, который определяет критерии, установленные для доноров глаза, чтобы быть приемлемыми. Например доноры должны иметь заболеваний не известных сетчатки глаза, глаза/глобусы извлекаются в течение 10 ч после смерти и глобусы прибыть в лаборатории в течение 48 ч после смерти (через ночь доставки пакетов на льду). Укажите соответствующий возрастной диапазон и количество глаз, необходимых для статистического анализа, например., пять пар глобусы от доноров в возрасте 20-49 лет и пять пар глобус от доноров в возрасте 50-89 лет.
Глобусы глаз зависит, как правило в среднем десять пар глобусы доступны каждый месяц. Глаз пакет прибывает с основным, обезличенных доноров информацию: возраст, раса, смерти, причина смерти и краткое Прошлая история болезни (перечень заболеваний или сопутствующих заболеваний).
Самое главное уборки эксплантов мембраны Бруха человека требует удаления переднего сегмента глаза и стекловидного тела, позволяя для изоляции ПЭС-Бруха мембраны Хориоидея комплекса. После того, как мембрана Бруха изолированных, НПП клетки могут посеян на бесклеточной эксплантов в различных концентрациях и культивировали для вниз по течению экспериментов. Подготовка и процедурные обработки как описано здесь является критической, уделяя внимание ориентации мембраны Бруха-изолированные убедиться Ламинальный поверхности Облицовка вверх пока не касаясь поверхности механически, чтобы избежать повреждения Структура поверхности внеклеточного матрикса.
Следует также отметить, что при использовании систем экспланта мембраны Бруха, есть некоторые переменные, которые могут повлиять на результаты течению экспериментов например геномные фона отдельных доноров, возраст мембраны Бруха, или посмертных время Брух мембраны и расположение мембраны Бруха, т.е., Центральной или периферической части эксплантов мембраны Бруха. Как и в случае с другими исследования тканей человека, один необходимо набирать номер образца глаз соответствующих доноров необходимой статистической мощности и соответствовать эпохе доноров при необходимости. Установления строгих критериев для принятия глаза от глаз банков является критическим параметром. Примите только глаза, энуклеированные менее чем 10 h посмертных и подготовка мембраны Бруха могут быть собраны в течение 24-48 ч после смерти. На сайте зрительного нерва может использоваться в качестве маркера для ориентации и использовать те же самые места для экспериментальных и исследовательских групп. Принимая эти меры, можно свести к минимуму экспериментальной изменчивости.
В целом понимание ПЭС-Бруха мембраны Хориоидея комплекса и как она зависит от возраста и заболеваний имеет решающее значение для понимания ее вклад патофизиологии AMD. Модель системы, которые используют методы ex vivo являются ценным инструментом расследовать эти эффекты с помощью человеческих тканей. Здесь мы описываем методологии, которая использует эксплантов человека доноров как модель соответствующих ex vivo мембраны Бруха возрасте. Этот метод позволяет использовать возрасте и/или больного человека Бруха мембраны, как средство исследования расследовать, каким образом структурные изменения в матрице может повлиять на наложение НПП поведение клеток, включая вложения, распространением и ген выражение25 , 27. Успешное развитие подобных ex vivo модели систем будут далее наше понимание AMD и содействовать разработке новых терапевтических возможностей.

Возрастные структурные изменения человека Бруха мембраны, что обусловлено многими факторами, включая нитрозилирующий и окислительного стресса, оказывает несколько пагубное влияние на функции сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) клеток и способствует патология возрастной макулярной дегенерации (AMD)1,2,3,4,5,6,,78,9 . При рассмотрении клеточной терапии замены для продвинутых атрофический AMD или географической атрофии, лечение, скорее всего, потребуется трансплантация клеток на кровати НПП атрофию клеток. Возрастные изменения в пределах мембраны Бруха человека может неблагоприятно повлиять на успех пересаженных графтов клеток ПЭС, учитывая ущерб внеклеточного матрикса6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. исследование человека биологии мембраны Бруха и как структурные изменения в пределах матрицы способствуют прогрессии для AMD является жизненно важным для понимания болезни патологии. Таким образом существует для исследователей в области связанных с возрастом глаз крайне необходимо разработать протоколы, которые описывают ex vivo уборки возрасте и/или больного человека Бруха мембраны.
Исторически это было трудно модель возрастных расстройств, таких как географической атрофии и возрасте человека Бруха мембраны в животных23. Эта трудность возникает от нескольких факторов, включая продолжительность жизни людей, по сравнению с грызунов и других видов, часто используемые для моделирования заболевания, а также отсутствие макулы большинства позвоночных24. Преимуществом метода, описанного в настоящем документе является, что клетки могут быть проверены непосредственно на мембране Бруха, извлеченные из post mortem глаза пожилых и больных лиц. Общая цель этой статьи заключается в обеспечении подробная методология для модели ex vivo возрасте и/или больного человека Бруха мембраны, включая изоляции человека Бруха мембраны эксплантах от человека доноров и посева НПП клетки для вниз по течению экспериментов. Эта модель может служить соответствующей модели для изучения вклада внеклеточного матрикса повреждения на НПП клеток функции патологии20,25,26,27,и28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Помимо витаминов и антиоксидантов, рекомендованных в исследовании болезни глаз возрастной Существует нет эффективной терапии для «сухой», или атрофический возрастной макулярной дегенерации (AMD) который представляет 90% случаев. Терапии необходимо замедлить или задержать развитие географической атрофии (GA), и понимание патологии мембраны Бруха является частью этого процесса. Изменения в мембране Бруха человека предшествуют прогрессирование AMD, способствуя повреждения сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) клетки. Учитывая отсутствие достаточных животных моделей для изучения AMD, модели ex vivo мембраны Бруха возрасте человека служат полезным инструментом для изучения поведение клеток НПП от увековечен и начальных клеточных линий, а также линии НПП производные от индуцированных плюрипотентных стволовых клетки (iPSCs). Здесь мы представляем подробный метод, который позволяет одному определить эффекты НПП клеток поведения посеян на собранные человека Бруха мембраны эксплантов человека доноров, включая вложения, апоптозе и пролиферации, способность фагоцитируют фоторецепторных внешней сегменты, создание полярности и экспрессии генов. Этот assay предоставляет модель ex vivo мембраны Бруха возрасте оценить функциональные характеристики НПП клеток когда посеян на престарелых/скомпрометированы внеклеточного матрикса.

Когда этот протокол выполняется должным образом, можно определить влияние возрасте и/или больного человека Бруха мембраны на НПП клеточной функции по созданию полярности и внешних кровь сетчатки барьер, поляризованные секрецию факторов роста и цитокинов, и фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных стержня.
Мы позволили получить данные, которые демонстрируют фенотип болезни на мембране Бруха возрасте человека. Например культивирование клеток ПЭС на возрасте человека Бруха мембраны эксплантов уменьшается НПП мобильные приложения (рис. 3). НПП клетки культивировали на мембране Бруха возрасте человека снижает способность этих клеток фагоцитируют стержень внешней сегментов (ROS), критические функции НПП (рис. 4). Кроме того можно выявлять и сравнении на эти кнопки эксплантов с помощью терминала deoxynucleotidyl трансферазы dUTP Ник маркировки конце (TUNEL) пятно как описано в предыдущей работе26apoptotic клетки. Эффекты возрасте и/или больного человека Бруха мембраны на НПП клетки генов выражение профиль может быть определена с помощью технологии microarray. Мы продемонстрировали, что НПП экспрессии генов в клетки изменяется при культивированный на мембране Бруха человека от людей старшего возраста, по сравнению с эксплантов от молодых лиц (рис. 5)27. Для статистического анализа эксплантов от по крайней мере 3-5 человека доноров используются на группу.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление изоляции мембраны Бруха человека от доноров глаз. Мембраны Бруха человека собирают путем удаления склеры, переднего сегмента, сетчатки, стекловидного тела, и родной сетчатки пигментные клетки эпителия (ПЭС). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Рисунок 2. Изолированные человека Бруха мембраны (БМ) в культуре блюдо. (A) схема человека Бруха мембраны эксплантов (каждый 1,5 дюймов в диаметре, с затвердевшей агарозном геле) помещены в 60 × 15 мм пенополистирола клетки культуры блюдо (BM лицом вверх) заполнены с теплой жидкой агарозы в нижней части блюда. (B) человека Бруха мембраны экспланта, который был trephined в несколько 6 мм круглые кнопки (эксплантов), каждый ВЛ который был затем помещается на 4% агарозном при 37 ° C в не лечение полистирол о 96-луночных пластины хорошо. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Рисунок 3. Клетки сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) приложения ставку на молодых и пожилых людей Бруха мембраны (BM). Основная НПП клетки были посеяны на мембраны Бруха эксплантах от молодого человека (< 50-летний, n = 3) или старше (> 70-летнего, n = 5) глаза доноров за три недели. Скорость вложений ячейки был измерен пробирного жизнеспособность клеток МТТ. Пожилых людей Бруха мембраны снизил ставку вложение клеток ПЭС на 24% (молодые BM 100 + / 8,54 с.е. против старых BM 76.65 + / 1,44 с.е.). p < 0,05, с.е. = Стандартная ошибка.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Рисунок 4. Сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) клеток фагоцитоза зависит от возраста человека Бруха мембраны (BM). Первичный НПП клетки культивировали на пожилых человека мембраны Бруха эксплантах имел пониженной способностью фагоцитируют стержень внешней сегментов (ROS) (молодые BM 873 + / 9.3 с.е., n = 5 против старых BM 608 + / 25,4 с.е., n = 5). p < 0.01, с.е. = Стандартная ошибка.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Рисунок 5. Количество сетчатки пигмента эпителия (ПЭС) клетки генов выражена в каждой пробе, выращиваются на young или пожилых людей Бруха мембраны эксплантах. Там было больше разброс в количество генов, выраженная в первичных клеток НПП посеян на старых против молодого человека Бруха мембраны (6201 ± 388 против 6439 ± 80, соответственно); пяти эксплантов были протестированы для каждой возрастной группы. С полного разрешения всех авторов Цай, H и др. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации культивирования пигмента сетчатки (ПЭС) клеток эпителия на возрасте и/или больного человека Бруха мембраны. Этот метод подходит для изучения НПП поведение клеток на скомпрометированных внеклеточного матрикса.

Культивирование клеток эпителия сетчатки пигментного модель Ex Vivo мембраны Бруха возрасте человека на

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Оптимизированный<em&gt; Экс-ово</em&gt; Культивирование куриных эмбрионов в продвинутых стадиях разработки

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Создание клинически значимых<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мок хирургии катаракты модель для исследования Эпителиальный заживления раны в родной микроокружения

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Инженерные трансплантации подходит сетчатки пигментного эпителия ткани, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...