Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Denna forskning stöds av forskning för att förhindra blindhet, New York, www.rpbusa.org och Greater New York Center för retinala degenerativa sjukdomen Foundation kämpar blindhet, www.blindness.org. Författarna vill tacka Luanna Bartholomew, Ph.D., för hennes kritiska granskning av detta manuskript.

Följande protokoll utförs i anslutning till principerna i Helsingforsdeklarationen och riktlinjerna för Yale University mänskliga forskningsetisk kommitté.
1. inköp mänskliga givare ögon
<ol><li>Få mänskliga givare glober från den nationella sjukdom forskning Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Beroende på projektet, att förbereda varje experimentella gruppen inte mindre än tre par givare ögon.</li>
	<li>Enucleate givare ögon inom 10 h och fartyg inom 48 h efter slakt. Sedan transportera ögonen till laboratoriet i sterila Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) odlingsmedium på is. Tidigare har rapporterade studier visat att givaren ögon skördas och transporteras i denna mode bevara biologiska funktioner och aktiviteter i Bruchs membran25,26,29.</li>
</ol>2. upptagning av mänskliga Bruchs membran Explants
<ol><li>Plats varje öga på en 1,5 x 1,5 tums gasbinda indränkt med koldioxid-oberoende DMEM media i ett 100 mm kultur skålen och användning fina blad sax göra ett snitt genom sklera 3 mm posteriort om limbus och runt om förlängning i endera riktningen.</li>
	<li>Gör en fullhudsskador omkretsriktningen snitt (penetrerande att glaskroppen) 1 mm posterior till den ora serrata. Ta bort och kassera det främre segmentet (hornhinnan, linsen och iris), glaskroppen och näthinnan.</li>
	<li>Använd fina kirurgisk sax för att göra fyra radiella snitt mellan sklera och åderhinnan, och då skal sklera från periferin till synnerven, samtidigt noga med att undvika att slita i åderhinnan/Bruchs membran komplexa.</li>
	<li>Därefter gör en omkretsriktningen snitt genom suprachoroidal utrymme längs den ora serrata och skala den RPE-Bruchs membran-åderhinnan komplex posteriort från sklera.</li>
	<li>Ta bort infödda RPE-cellerna genom att bada explant med 0,02 M ammoniumhydroxid i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) i en 60 x 15 mm polystyren petriskål under 20 minuter vid rumstemperatur, följt av tvättning det tre gånger i DPBS (figur 1).</li>
	<li>Flyt den Bruchs membran komplexa explant i koldioxid-fria medier över ett olaminerade, hydrofoba 65 µm tjock polytetrafluoreten membran med 0.2 µm porer, med den basala lamina lagret av varje explant inför membranet.</li>
	<li>Placera en polytetrafluoreten membran med Bruchs membran explant på en fritted glas i en glas mikroanalys vakuum filterhållaren system.</li>
	<li>Platta till böjda kanterna från koroidal sida med fina pincett belagda med Teflon, noga med att inte röra den Bruchs membran basala laminin sida.</li>
	<li>Värm 15 mL agaros (4% i DPBS) och sedan kyla den till 37 ° C. Häll 15 mL liquidized gelen på det Bruchs membran-åderhinnan komplex från koroidal-sida samtidigt som en skonsam sugkraft för att garantera att explant förblir platt. Hålla vävnaden vid 4 ° C för 2-3 min att stelna Agarens och dra sedan av polytetrafluoreten membranet bort.</li>
	<li>Placera den Bruchs membran explant (1,5 inches i diameter, inom stelnat agarosgel) i en 60 x 15 mm polystyren cell kultur maträtt (med Bruchs membran uppåt) som har varit kantad med varm flytande agaros på botten av skålen fixar den Bruchs membran explant på botten av brunnen med explant basala laminin lagret uppåt.</li>
	<li>Agarens kommer stelna inom 2-3 min i rumstemperatur att stabilisera den Bruchs membran bladsticklingar i kultur skålen. Täcka den Bruchs membran explants i kulturen skålen med DPBS och lagra skålen vid 4 ° C för framtida bruk. Figur 2A visar den isolerade Bruchs membran explants i en 60 x 15 mm kultur maträtt.</li>
	<li>Om systemets önskad kultur är i en plattan med 96 brunnar, placera den Bruchs membran explant (1,5 inches i diameter, med stelnad agarosgel) på en platt Teflon ark med laminin-Sidan upp.</li>
	<li>Med hjälp av en trephine, skära fem eller sex, 6 mm-runda knappar från den Bruchs membran komplexa explant och placera varje på 4% agaros vid 37 ° C i en icke-behandlade polystyren väl av en plattan med 96 brunnar. Agarens kommer stelna inom 2-3 min i rumstemperatur fixar den Bruchs membran bladsticklingar (knappar) på undersidan av varje brunn. Obs: Figur 2B visar trephined Bruchs membran knappar i en plattan med 96 brunnar. Typiskt, 9-11 knappar eller bladsticklingar kan skördas från varje öga.</li>
</ol>3. odling av Retinal Pigment epitel (RPE) celler på mänskliga Bruchs membran Explants
<ol><li>Vid mottagandet av givare ögonen, ren extraocular vävnaden med DPBS. Gör en omkretsriktningen snitt 5 mm nedanför iris-sklera touch punkt (pars plana) in subretinalområdet. Kassera den främre segmentet, glaskroppen och näthinnan.</li>
	<li>Tvätta ögonmusslan, som innehåller Bruchs membran och RPE ark, med kall DPBS. Separera RPE-cellerna med 5 mL av 0,25% trypsin längre än 10 min för varje öga. Släcka trypsin reaktion med 25 mL DMEM komplett medium med 15% fetalt bovint serum (FBS) värmde vid 37 ° C i en 50 mL tub.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 200 × g i 10 min vid 24 ° C, och återsuspendera pelleten i 5 mL DMEM komplett medium (med 15% FBS).</li>
	<li>Räkna cellerna och utsäde 15.000 livskraftig RPE-cellerna på den basala lamina av varje olika år Bruchs membran bladsticklingar (knappar) i en plattan med 96 brunnar i 200 µL serum-fri minsta nödvändiga media (MEM) som innehåller antibiotika (100 IE/mL penicillin G, 100 mg / mL streptomycin, 5 mg/mL gentamicin och 2,5 mg/mL amfotericin B). Förutsatt att en cell diameter 20 µm, plätering på densiteten gör att RPE-celler att täcka ungefär 15% av området plätering.</li>
	<li>Platta celler till knappen, whereby cell densiteten kan sedan ökas stegvis upp till 100% sammanflödet beroende på effekten av varje parameter på cell beteende.</li>
	<li>Tillåta cellerna att fästa explant för 24 h i en fuktad atmosfär av 95% air/5% CO2 vid 37 ° C. Försiktigt ändra medium med varma komplett DMEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Ingen av författarna har några kommersiella upplysningar att deklarera.

Äldre människors Bruchs membran (extracellulär matrix) bidrar till sjukdomsförloppet av AMD och således finns det ett behov av att förstå hur denna förändrade matris bidrar till RPE cellfunktion. Bristen på tillräcklig djurmodeller studera åldersrelaterade förändringar i AMD, kan ex vivo modellsystem som efterliknar effekterna av sjukdomen tjäna som ett värdefullt verktyg att förstå patofysiologin. Den metod som beskrivs i detta manuskript kan användas konsekvent isolera mänskliga Bruchs membran explants och kultur RPE-celler, inklusive primära, förevigade eller stamceller-derived RPE cellinjer.
Som tidigare nämnts köps mänskliga Bruchs membran bladsticklingar från NDRI. Ett protokoll upprättas med NDRI som anger kriterierna för givare ögon kan accepteras. Exempelvis givare måste ha inga kända retinal ögonsjukdomar, ögon/glober hämtas inom 10 h efter döden och glober anländer till laboratoriet inom 48 h efter döden (via paketet övernattbefordran på is). Ange lämplig ålder och antal ögon behövs för statistisk analys av studien, t.ex., fem par jordglober från givare i åldrarna 20 – 49 år och fem Globen par från givare mellan 50-89 år.
Tillgången till ögat glober varierar, vanligtvis i genomsnitt tio par jordglober tillgänglig varje månad. Ögat paketet anländer med grundläggande, avidentifierad givare information: ålder, ras, död, dödsorsak, och kort tidigare sjukdomshistoria (sjukdom notering eller samsjuklighet).
Viktigast av allt, kräver skörd mänskliga Bruchs membran bladsticklingar avlägsnande av den främre delen av ögat och glaskroppen, möjliggör för isolering av RPE-Bruchs membran-åderhinnan komplex. När den Bruchs membran är isolerade, kan RPE-celler vara seedade på de acellulärt bladsticklingar vid varierande koncentrationer och odlade för nedströms experiment. Förberedelse och processuella hantering som beskrivs häri är kritisk, att uppmärksamma orienteringen för den isolerade Bruchs membran kontrollera laminal ytan är vänd upp medan inte röra ytan mekaniskt för att undvika att skada den extracellulär matrix ytstruktur.
Det bör också noteras att när du använder den Bruchs membran explant system, det finns vissa variabler som kan påverka resultaten av nedströms experiment såsom enskilda givare genomisk bakgrund, ålder av den Bruchs membran, eller efter döden tid av Bruchs membran, och platsen för den Bruchs membran, dvs., central eller perifer del av Bruchs membran bladsticklingar. Som med någon annan mänsklig vävnad studie, måste en rekrytera lämpliga givare ögat provnumret för att ha nödvändiga statistiska makt och matcha givare ögat ålder vid behov. Att fastställa strikta kriterier för att acceptera ögon från ögat banker är en kritisk parameter. Bara acceptera ögon som är enucleated mindre än 10 h efter döden och som den Bruchs membran förberedelse kan skördas inom 24-48 h efter döden. Synnerven webbplatsen kan användas som en markör för orientering och använder samma platser för experimentell och styra studiegrupper. Genom att vidta dessa åtgärder, kan man minimera experimentella variabilitet.
I sammanfattning, förståelse av RPE-Bruchs membran-åderhinnan komplex och hur den påverkas av ålder och sjukdom är avgörande för att förstå dess bidrag till patofysiologin av AMD. Modellsystem som använder tekniker för ex vivo är ett värdefullt verktyg för att undersöka dessa effekter med mänsklig vävnad. Häri, beskriver vi en metodik som sysselsätter mänskliga givare bladsticklingar som relevanta ex vivo modell av åldern Bruchs membran. Denna teknik gör att man kan använda äldre eller sjuka människors Bruchs membran som ett verktyg för forskning att undersöka hur strukturella förändringar inom matrisen kan påverka överliggande RPE cell beteende inklusive fastsättning, spridning och gen uttryck25 , 27. framgångsrik utveckling av liknande ex vivo modellsystem kommer att främja förståelsen av AMD och underlätta utvecklingen av nya terapeutiska alternativ.

Åldersrelaterade strukturförändringar att mänskliga Bruchs membran, som orsakas av många faktorer, inklusive nitrosative och oxidativ stress, utövar flera skadliga effekter på funktionen av retinal pigment epitel (RPE) celler och bidrar till den patologi av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . När man överväger cell substitutionsterapi för avancerade atrofisk AMD eller geografisk atrofi, kommer att behandling sannolikt kräva transplantation av celler på en bädd av RPE cell atrofi. Åldersrelaterade förändringar inom mänskliga Bruchs membran kan negativt påverka framgång transplanterade RPE cell ympkvistar, med tanke på skador till extracellulära matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. undersöka mänskliga Bruchs membran biologi och hur strukturella förändringar inom matrisen bidra till progression till AMD är avgörande för att förstå sjukdomen patologi. Således finns det kritiska behov av utredarna i fältet åldersrelaterade ögat för att utveckla protokoll som beskriver ex vivo skörd av äldre eller sjuka människors Bruchs membran.
Historiskt sett har det varit svårt att modell åldersrelaterade sjukdomar såsom geografisk atrofi och ett år mänskliga Bruchs membran i djur23. Denna svårighet uppstår flera faktorer av livslängden hos människor jämfört med gnagare och andra arter som ofta används för sjukdom modellering, liksom avsaknaden av en makula i de flesta ryggradsdjur24. Fördelen med den metoden som beskrivs häri är att celler kan testas direkt på Bruchs membran utvinns ur post mortem ögon äldre eller sjuka individer. Det övergripande målet med denna artikel är att ge en detaljerad metod för en ex vivo modell av äldre eller sjuka människors Bruchs membran, inklusive isolering av mänskliga Bruchs membran explants från mänskliga donatorer och odling av RPE-celler för nedströms experiment. Denna modell kan fungera som en relevant modell för att undersöka bidraget av extracellulärmatrix skada RPE cell funktion och patologi20,25,26,27,28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Förutom vitaminer och antioxidanter som rekommenderas av åldersrelaterad öga sjukdom studien, finns det ingen effektiv behandling för ”torr” eller atrofisk åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) som representerar 90% av fallen. Terapier behövs för att bromsa eller fördröja utvecklingen av geografisk atrofi (GA) och förstå Bruchs membran patologi är en del av denna process. Förändringar i människors Bruchs membran föregår utvecklingen av AMD genom att bidra till skadan av retinal pigment epitel (RPE) celler. Bristen på tillräcklig djurmodeller studera AMD, fungera ex vivo modeller av äldre människors Bruchs membran som ett användbart verktyg att studera beteendet hos RPE-celler från förevigade och primär cell linjer samt RPE linjer härrör från inducerade pluripotenta stamceller celler (iPSCs). Här presenterar vi en detaljerad metod som gör att man kan avgöra effekterna av RPE cell beteende seedade på skördade mänskliga Bruchs membran bladsticklingar från mänskliga donatorer, inklusive bifogade filer, apoptos och spridning, förmåga att fagocytera ljusmätare yttre segment, inrättandet av polaritet och genuttryck. Denna analys ger en ex vivo -modell av åldern Bruchs membran att bedöma funktionella egenskaper hos RPE-celler när seedade på åldern/äventyras extracellulärmatrix.

När detta protokoll utförs på rätt sätt, kan man bestämma åldern eller sjuka människors Bruchs membran effekter på RPE cellens funktion av inrättandet av polaritet och den yttre blod retinal barriär, polariserade utsöndringen av tillväxtfaktorer och cytokiner, och fagocytos av ljusmätare spö yttre segment.
Vi har genererat data som visar en sjukdom fenotyp på åldern mänskliga Bruchs membran. Till exempel åldern odla RPE-celler på mänskliga Bruchs membran bladsticklingar minskar RPE cell återfastsättning av (figur 3). RPE-celler odlade på åldern mänskliga Bruchs membran minskar dessa celler förmåga att fagocytera spö yttre segment (ROS), en kritisk RPE funktion (figur 4). Apoptotiska celler kan dessutom identifieras och jämförde på dessa knappen bladsticklingar använder en terminal deoxynucleotidyl transferas dUTP nick slutet-märkning (TUNEL) fläck som beskrivs i föregående arbete26. Effekterna av en äldre eller sjuka människors Bruchs membran på RPE cell gene expression profil kan bestämmas med hjälp av microarray teknik. Vi har visat att RPE cell genuttryck ändras när odlade på mänskliga Bruchs membran från äldre individer jämfört med bladsticklingar från yngre individer (figur 5)27. För statistisk analys används bladsticklingar från minst 3-5 mänskliga donatorer per grupp.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figur 1. Schematisk framställning av isoleringen av mänskliga Bruchs membran från givare ögon. Mänskliga Bruchs membran skördas genom att ta bort den sklera främre segmentet, näthinnan, glaskroppen, och infödda retinal pigment epitelceller (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figur 2. Isolerade mänskliga Bruchs membran (BM) i en kultur maträtt. (A) Schematisk bild av mänskliga Bruchs membran bladsticklingar (varje 1,5 inches i diameter, med stelnad agarosgel) placeras i en 60 × 15 mm polystyren cell kultur maträtt (BM uppåtvänt) fylld med varm flytande agaros på botten av skålen. (B) en mänsklig Bruchs membran explant som har varit trephined i ett par 6 mm runda knappar (bladsticklingar), varje öde som placerades sedan på 4% agaros vid 37 ° C i en icke-behandlade polystyren väl av en plattan med 96 brunnar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figur 3. Retinal pigment epitel (RPE) cell återfastsättning av räntan på unga och äldre människors Bruchs membran (BM). Primära RPE-celler var seedad på mänskliga Bruchs membran explants från young (< 50-åriga, n = 3) eller äldre (> 70 år gammal, n = 5) givare ögon i tre veckor. Bifogad fil cellhastighet mättes av MTT cell livskraft assay. Äldre människors Bruchs membran minskade andelen RPE cell fastsättning med 24% (unga BM 100 +/-8,54 S.E. vs äldre BM 76.65 +/-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = standard fel.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figur 4. Retinal pigment epitel (RPE) cell fagocytos påverkas av åldern av den mänskliga Bruchs membran (BM). Primära RPE-celler odlade på äldre mänskliga Bruchs membran explants hade en nedsatt förmåga att fagocytera spö yttre segment (ROS) (unga BM 873 +/-9,3 S.E., n = 5 vs äldre BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = standard fel.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figur 5. Antal retinal pigment epitel (RPE) cell gener uttrycks i varje prov som odlade på ung eller äldre människors Bruchs membran explants. Det fanns fler scatter antalet gener uttrycks i primära RPE-celler seedade på äldre jämfört med yngre människors Bruchs membran (6201 ± 388 vs. 6439 ± 80, respektive); fem bladsticklingar testades för varje åldersgrupp. Presenteras med behörigheten full av alla författarna av Cai, H et al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Målet med detta protokoll är att demonstrera odling av näthinnans pigment epitelceller (RPE) på äldre eller sjuka människors Bruchs membran. Denna metod är lämplig att studera RPE cell beteende på en komprometterad extracellulärmatrix.

Odling av Retinal Pigment epitelial celler på en Ex Vivo modell av äldre människors Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimerad<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Odling av kycklingembryon till avancerade stadier av utveckling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Derivering av näthinnans pigmentepitel celler från stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Inrättande av en kliniskt relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock kataraktoperation Modell för utredning Epithelial sårläkning i en Native mikromiljö

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metod för time-lapse avbildning av odlade Rat Mesenteric Mikrovaskulära Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Spårning av mänskliga Adipose-derived mesenkymala stamceller i en råtta knä artros modell med fluorescerande lipofila membran färgämne

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering Transplantation-lämplig Retinal Pigment epitel vävnad härrör från mänskliga embryonala stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...