Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Bu araştırma retina dejeneratif hastalığı Vakfı mücadele görme engelliler için körlüğü önlemek, New York, www.rpbusa.org ve büyük New York Merkezi araştırma tarafından desteklenmektedir www.blindness.org. Yazarlar Luanna Bartholomew, doktora, bu el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol uyum içinde Helsinki Bildirgesi ve Yale Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi kuralları ilkelerinin için gerçekleştirilir.
1. kaynak insan donör gözler
<ol><li>İnsan donör küre Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI, Philadelphia, PA) edinin. Projeye bağlı olarak donör gözleri en az üç çift deneysel her grup için hazırlamak.</li>
	<li>Donör gözleri 10 h içinde ve gemi 48 h post mortemiçinde enucleate. Sonra steril Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) kültür orta buz üzerinde laboratuvarda gözlere taşıma. Daha önce bildirilen çalışmalar donör gözleri ve hasat Bruch'ın membran25,26,29faaliyetlerinin ve biyolojik özellikleri bu moda koru taşınan göstermiştir.</li>
</ol>2. hasat insan Bruch'ın membran Explants
<ol><li>100 mm kültür çanak ve bir kesi ile sklera 3 mm arka limbus için yapmak için kullanmak iyi bıçak makas karbon dioksit bağımsız DMEM medya ve çepeçevre her iki yönde uzanan bir 1.5 x 1.5 inç gazlı bez her göz batırılmış bir yer.</li>
	<li>Yapmak bir tam-kalınlık sirkumferansiyel kesi (camsı için delici) 1 mm arka ora serrataiçin. Kaldırmak ve anterior segment (kornea, lens ve Iris), Vitre ve retina atın.</li>
	<li>İyi Cerrahi makas sklera ve koroid arasında dört Radyal kesi yapmak ve o zaman soyma sklera optik sinir, çevre uzak koroid/Bruch'ın membran karmaşık yırtılma önlemek için karşılamaya çalışırken.</li>
	<li>Ardından, çevresel bir kesi ora serrata boyunca suprachoroidal uzayda yapmak ve RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık özafagusu sklera üzerinden soyma.</li>
	<li>Yerel RPE hücrelerinin explant ile 0,02 M amonyum hidroksit Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 60 x 15 mm polistren Petri kabına DPBS (şekil 1) üç - kez yıkayarak takip oda sıcaklığında 20 dakika içinde banyo tarafından kaldırın.</li>
	<li>Bruch'ın membran karmaşık explant karbondioksit içermeyen medyada membran bakan her explant Bazal lamina tabakası ile 0.2 µm gözenekli bir unlaminated, hidrofobik 65 µm kalınlığında politetrafloroetilen membran üzerinde süzülüyor.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant ile politetrafloroetilen membran fritted cam desteğinde bir cam microanalysis vakum filtre tutucu sistemi yerleştirin.</li>
	<li>Bruch'ın membran Bazal laminin yan dokunmamaya dikkat çekici Teflon ile kaplı ince Forseps ile choroidal tarafındaki kıvrılmış kenarlar düzleştirin.</li>
	<li>Özel (DPBS %4) 15 mL ısı ve sonra 37 ° C'ye serin Sonra explant düz kalmasını güvence altına almak için nazik emiş uygulanırken Bruch'ın membran-koroid karmaşık choroidal taraftan üzerine liquidized jeli 15 mL dökün. 2-3 dk özel kuvvetlendirmek ve uzak politetrafloroetilen membran soyma için 4 ° C'de doku tutun.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel içinde 1,5 inç) Bruch'ın membran düzeltmek için çanak altındaki sıcak sıvı özel ile kaplı bir 60 x 15 mm polistren hücre kültür yemek (ile Bruch'ın membran yukarı dönük olacak şekilde) yerleştirin Kuyunun dibinde yukarı dönük olacak şekilde explant Bazal laminin tabaka ile explant.</li>
	<li>Özel Bruch'ın membran explants kültür tabak içinde stabilize etmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Bruch'ın membran kültüründe explants kapak DPBS ile yemek ve yemek ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın. Şekil 2A izole Bruch'ın membran bir 60 x 15 mm kültür tabak içinde explants gösterir.</li>
	<li>İstenen kültür sistemi içinde 96-şey plaka ise, Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel ile 1,5 inç) laminin tarafı ile düz bir Teflon sayfada yukarı yerleştirin.</li>
	<li>Beş ya da altı, kesilmiş bir trephine kullanarak 6 mm-daire düğme Bruch'ın membran karmaşık gelen explant ve her % 4 özel üzerinde sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de yerleştirin. Özel Bruch'ın membran explants (düğme) her kuyunun düzeltmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Not: Şekil 2B trephined Bruch'ın membran düğmeleri bir 96-şey plaka gösterir. Genellikle, 9-11 düğmeleri veya explants her gözünden hasat edilebilir.</li>
</ol>3. insan Bruch'ın membran üzerinde retina Pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının Explants
<ol><li>Donör gözleri aldıktan sonra DPBS ile Gözdışı doku temiz. Çevresel bir kesi Iris sklera aşağıda 5 mm nokta (pars plana) subretinal boşluğa dokunmatik olun. Anterior segment, Vitre mizah ve retina atmak.</li>
	<li>Bruch'ın membran ve soğuk DPBS ile RPE levha içerir kadeh yıkayın. 5 mL % 0.25 tripsin artık her göz örnek için 10 dk daha için de RPE hücrelerle ayırmak. 50 mL tüp içinde 37 ° C'de ısındı % 15 fetal sığır serum (FBS) ile DMEM tam orta tripsin tepki 25 mL ile gidermek.</li>
	<li>200 × g 24 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi ve Pelet 5 mL DMEM tam orta resuspend (% 15 ile FBS).</li>
	<li>Hücreleri saymak ve antibiyotik içeren her çeşitli yaşlı Bruch'ın membran explants (düğme) 200 µL serum-Alerjik minimum temel medya (MEM) bir 96-şey plaka Bazal lamina üzerine 15.000 RPE hücrelerin tohum (100 IU/mL penisilin G, 100 mg / mL streptomisin, 5 mg/mL gentamisin ve 2,5 mg/mL Amfoterisin B). Bu yoğunluk kaplama 20 µm hücre çapını varsayarak RPE hücrelerinin kaplama alanı yaklaşık % 15'i karşılamak izin verir.</li>
	<li>Hücreleri sayede hücre yoğunluğu sonra stepwise kadar % 100 izdiham bağlı olarak her parametre etkisi hücre davranış için arttırılabilir düğmesi üzerine plaka.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de % 95'i air/5% CO2 oksijen bir ortamda 24 h için explant takmak izin Yavaşça orta sıcak tam DMEM ile değiştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbiri bildirmek için herhangi bir ticari açıklamalar var.

Yaşlı insan Bruch'ın membran (hücre dışı matriks) AMD hastalık ilerleme katkıda bulunur ve böylece bu değiştirilmiş matris RPE hücre disfonksiyonu için nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerek yoktur. Yaşa bağlı değişimler AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, hastalığın etkileri taklit ex vivo model sistemleri patofizyolojisi anlamak için değerli bir araç olarak hizmet verebilir. Bu el yazması açıklanan metodoloji tutarlı bir şekilde Bruch'ın membran explants ve kültür RPE hücrelerinin, birincil, ölümsüzleştirdi veya kök hücre kaynaklı RPE hücre hatları dahil olmak üzere insan yalıtmak için kullanılabilir.
Daha önce de belirtildiği gibi insan Bruch'ın membran explants NDRI kaynaklı. Bir iletişim kuralı kabul edilebilir donör gözler için ayarlanan ölçütleri belirten NDRI ile kuruldu. Örneğin, bağış yok bilinen retina göz hastalıkları olması gerekir, gözleri/küre içinde 10 h ölümünden sonra alınır ve küre 48 saat içinde laboratuvarda ölümünden sonra (yolu ile paket teslimâtı buzda) geliyor. Uygun yaş aralığı ve gözleri bir çalışma, örneğinistatistiksel analiz için gerekli sayısını belirtin., Küre bağış bağış yaşları 50-89 arasında beş dünya çift 20-49 yaşları arasındaki beş çift.
Genellikle on çifti küre kullanılabilir her ay ortalama göz küre kullanılabilirliği değişir. Göz paket temel, de-tanımlanan donör bilgi ile geldi: yaş, ırk, ölüm, ölüm nedeni, zamanı ve tıp tarihi (hastalık listesini ya da comorbidities) kısa.
En önemlisi, insan Bruch'ın membran explants hasat göz ve camsı RPE Bruch'ın membran-koroid kompleks izolasyon için sağlar, anterior segment kaldırılmasını gerektirir. Bruch'ın membran izole olduğunda, RPE hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda acellular explants üzerine tohumlari ve aşağı akım deneyler için kültürlü. Hazırlık ve yordamsal işleme burada açıklandığı gibi kritik, laminal yüzeyi bakan-up sırasında değil müessir yüzeyin mekanik zarar görmesini önlemek için emin olmak için izole Bruch'ın membran yönünü dikkat hücre dışı matriks yüzey yapısı.
Bu da Bruch'ın membran explant sistemleri kullanırken, orada bireysel donör genomik arka plan gibi aşağı akım deneylerin sonuçlarını, yaş Bruch'ın membran veya Bruch'ın öldükten sonra zaman etkileyebilecek bazı değişkenler belirtilmelidir membran ve konumunu Bruch'ın membran, i.e., merkezi veya periferik Bruch'ın membran explants bir parçası. Herhangi bir diğer insan dokusu çalışma ile gibi gerekli istatistiksel gücü var ve donör göz yaşı uygunsa eşleştirmek için uygun donör göz örnek numarası işe gerekir. Göz bankaları gözlerinden kabul etmek için sıkı kriterleri kurulması önemli bir parametredir. Sadece gözleri bu az 10 h öldükten sonra enucleated ve hangi Bruch'ın membran hazırlık içinde 24-48 h ölümünden sonra hasat edilebilir kabul. Optik sinir site yönlendirmesi için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve aynı yerlerde kullanmak deneysel ve çalışma grupları denetlemek. Bu önlemler alarak, bir deneysel değişkenlik en aza indirebilirsiniz.
Özetle, RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık ve nasıl yaş ve hastalık etkilenen anlayışı patofizyolojisi katkısı AMD anlamak için önemlidir. Ex vivo teknikler istihdam modeli sistemleri insan dokusu kullanarak bu efektleri araştırmak için değerli bir araç vardır. Burada, biz insan donör explants yaşında Bruch'ın membran ilgili ex vivo modeli olarak istihdam bir metodoloji tanımlamak. Bu teknik bir nasıl matris içinde yapısal değişiklikleri araştırmak için bir araştırma aracı RPE overlaying etkileyebilir gibi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran kullanmak izin verir ifade25 eki, yayılması ve gene de dahil olmak üzere hücre davranış , 27. başarılı benzer ex vivo modeli sistemlerinin geliştirilmesi AMD anlayışımız daha fazla ve yeni tedavi olanakları gelişimi kolaylaştırmak.

Yaşa bağlı nitrosative ve oksidatif stres de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından neden olduğu insan Bruch'ın membran yapısal değişikliklere giderek artan retina pigment epitel (RPE) hücreleri ve katkıda işlevi birden çok zararlı etkileri Patoloji yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Hücre replasman tedavisi için gelişmiş atrofik AMD ya da coğrafi Atrofi dikkate alınarak, tedavi büyük olasılıkla RPE hücre Atrofi bir yatak üzerine hücrelerinin nakli gerektirir. Yaşa bağlı değişiklikler insan Bruch'ın membran içinde hasar için hücre dışı matriks6,9,10,11 verilen transplante RPE hücre Greftler başarısını olumsuz yönde etkilenebilir , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch'ın membran Biyoloji ve nasıl matris içinde yapısal değişiklikler katkıda bulunmak için AMD ilerleme araştırılması insan hastalık patoloji anlamak için çok önemli. Böylece, ex vivo yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran hasat tarif protokolleri geliştirmek için yaşa bağlı göz alanındaki araştırmacılar için kritik bir ihtiyaç vardır.
Tarihsel olarak, bu modeli yaşa bağlı bozukluklar coğrafi atrofi ve hayvanlar23yaşında bir insan Bruch'ın membran gibi zor oldu. Bu zorluk birden fazla etkene kemirgenler ve modelleme hastalığı yanı sıra çoğu omurgalılar24yılında makula eksikliği için sık kullanılan diğer türler ile karşılaştırıldığında insanlar uzun ömürlü kaynaklanmaktadır. Burada açıklanan yöntemin avantajı hücreleri doğrudan yaşlı ve/veya hastalıklı bireylerin post mortem gözlerinden çıkarılan Bruch'ın membran üzerinde test edilebilir olduğunu. Bu makalede genel amacı yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran bir ex vivo modeli için detaylı bir metodoloji sağlamak için dahil olmak üzere insan Bruch'ın yalıtım membran insan bağış explants ve RPE tohum için hücreleri aşağı akım deneyler. Bu model hücre dışı matriks hasar RPE hücre işlevi ve patoloji20,25,26,27,28katkısını araştırmak için uygun bir model olarak hizmet verebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Vitaminler ve antioksidanlar Age-Related göz hastalığı çalışma tarafından önerilen bir yana, olguların % 90'ı temsil eden "kuru" veya atrofik yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için hiçbir etkili tedavi vardır. Tedaviler yavaş veya coğrafi Atrofi (GA) gelişimi geri zekalı için gereklidir ve Bruch'ın membran patoloji anlama bu sürecin parçasıdır. İnsan Bruch'ın zarda değişiklik AMD ilerlemesini retina pigment epitel (RPE) damage hücre katkıda bulunarak koyun. AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, yaşlı insan Bruch'ın membran ex vivo modelleri gibi davranış RPE hücrelerinin çalışma için yararlı bir araç ölümsüzleştirdi ve birincil hücre hatları gibi RPE satırları İndüklenmiş pluripotent kök elde edilen hizmet hücreler (iPSCs). Burada, bir hasat insan Bruch'ın membran explants eki, Apoptozis ve yaygın, photoreceptor dış işbirliği yeteneği de dahil olmak üzere insan bağışçılardan numaralı seribaşı RPE hücre davranış etkilerini belirlemek izin verir ayrıntılı bir yöntem mevcut kesimi, polarizasyon ve gen ekspresyonu kurulması. Bu tahlil ex vivo modeli ne zaman yaşlı/tehlikeye hücre dışı matriks seribaşı RPE hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yaşlı Bruch'ın membran sağlar.

Bu iletişim kuralı düzgün gerçekleştirildiğinde, kimse RPE hücre işlevi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini polarite ve dış kan retina bariyerini kurulması, büyüme faktörleri ve sitokinler polarize salgılanmasını tarafından belirleyebilirsiniz, ve fagositoz photoreceptor çubuk dış segmentleri.
Biz-si olmak oluşturmak bir hastalık fenotip yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde göstermek veri. Örneğin, üzerinde RPE hücrelerinin kültür insan Bruch'ın membran explants azalır RPE hücre yatıştırıldı (şekil 3) yaşlı. Yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde kültürlü RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS), işbirliği için kapasitesini bu hücreler bir kritik RPE işlev (şekil 4) azaltır. Ayrıca, apoptotik hücre tespit ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick son etiketleme (tünel) leke önceki iş26açıklandığı gibi kullanarak bu düğme explants karşılaştırıldığında. RPE hücre gen ifade profil bir yaşında ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini Mikroarray teknolojisi kullanılarak belirlenebilir. RPE hücre gen ekspresyonu insan Bruch'ın membran explants için genç bireyler (şekil 5)27karşılaştırıldığında büyük kişilerden kültürlü zaman değiştirilmez göstermiştir. İstatistiksel analiz için explants en az 3-5 insan bağışçılardan grubu başına kullanılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Şekil 1. Donör gözlerinden insan Bruch'ın membran izolasyon şematik gösterim. İnsan Bruch'ın membranlar sklera, anterior segment, retina, Vitre kaldırarak hasat ve yerel retina pigment epitel (RPE) hücreleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Şekil 2. İnsan Bruch'ın membran (BM) bir kültür tabak içinde izole. (A) insan Bruch'ın membran explants (çapı, katılaşmış özel jel ile her 1,5 inç) şematik bir 60 × çanak altındaki sıcak sıvı özel dolu 15 mm polistren hücre kültür çanak (BM yukarı doğru) yerleştirilir. (B) bu birkaç 6 mm dairesel düğme (explants), trephined bir insan Bruch'ın membran explant her ow sonra yerleştirdiği bir sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de % 4 özel tarih. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Şekil 3. Retina pigment epitel (RPE) hücre genç ve yaşlı insan Bruch'ın membran (BM) oranına yatıştırıldı. Bruch'ın membran explants--dan genç insan üzerine numaralı seribaşı birincil RPE hücrelerinin (< 50 yaşında, n = 3) veya büyük (> 70 yaşındaki, n = 5) donör gözler üç hafta için. Hücre eki hızı MTT hücre canlılığı tahlil tarafından ölçüldü. Büyük insan Bruch'ın membranlar %24 RPE hücre eki oranı azaldı (8,54 + / genç BM 100 S.E. büyük BM 76.65 1,44 +/-vs S.E.). p < 0,05, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Şekil 4. Retina pigment epitel (RPE) hücre fagositoz insan Bruch'ın membran (BM) yaşa göre etkilenir. Bruch'ın membran explants büyük insan kültürlü birincil RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS) işbirliği için azaltılmış bir yetenek vardı (9,3 +/-genç BM 873 S.E., n = 5 eski BM 608 25,4 +/-vs S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Şekil 5. Sayısı retina pigment epitel (RPE) hücre genler üzerinde genç kültürlü her örnek olarak ifade veya büyük insan Bruch'ın membran explants. Birincil RPE hücrelerinin üzerine numaralı seribaşı olarak ifade genlerin sayısının daha fazla dağılım oldu genç insan Bruch'ın membran karşı büyük (6201 ± 388 6439 ± 80, vs sırasıyla); Beş explants her yaş grubu için test edildi. Cai, tüm yazarların tam izni ile sunulan H ve ark. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...