Name: 2d and 3d echocardiography in the axolotl (ambystoma mexicanum)
Uploaded: 2018-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum at JoVE.com

Nós gostaríamos de reconhecer Kasper Hansen, Instituto de Biociências, Universidade de Aarhus para fornecer acesso e assistência com o micromanipulador eletrônico para aquisição de ecocardiográfica 3D.

Os procedimentos realizados neste protocolo estavam em conformidade com a legislação nacional dinamarquesa para o cuidado e uso de animais de laboratório e as experiências foram aprovadas pela inspecção de experimentos de Animal nacional dinamarquês (protocolo # 15-00615-0201-2015).
1. preparações
<ol><li>Preparar o axolote médio.<ol>
<li>Aplica água da torneira alta qualidade não-quimicamente tratada como meio de axolote. Se este não estiver disponível, aplica solução de 40%...

<ol>
	<li>Forouzanfar, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+Global+Burden+of+Ischemic+Heart+Disease.">Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease.</a> Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).</li><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2014).</li><li>Leferovich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+adult+MRL+mice.">Heart regeneration in adult MRL mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).</li><li>Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scarless+heart.">The scarless heart.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).</li><li>Nakada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+heart+regeneration+in+adult+mice.">Hypoxia induces heart regeneration in adult mice.</a> Nature. 541, 222-227 (2017).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury+induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).</li><li>Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+adult+newt+ventricle+to+injury.">Response of the adult newt ventricle to injury.</a> J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).</li><li>Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+developmental+cardiogenesis+governs+the+morphological+and+functional+regeneration+of+adult+newt+hearts+following+injury.">Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury.</a> Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).</li><li>Gressens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Lab Animal. 33, 41-47 (2004).</li><li>Cano-Mart&#237;nez, A., Vargas-Gonz&#225;lez, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., Le&#243;n-Oleda, M., Nieto-Lima, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+regeneration+in+the+axolotl+heart+(Ambystoma+mexicanum)+after+partial+ventricular+amputation.">Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation.</a> Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).</li><li>McCusker, C., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+model+for+regeneration+and+aging+research:+a+mini-review.">The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review.</a> Gerontology. 57, 565-571 (2011).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).</li><li>Nakamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+Baf60c+during+heart+regeneration+in+axolotls+and+neonatal+mice.">Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice.</a> Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).</li><li>Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Reconstruction+of+Chick+Embryo+Vascular+Geometry+Using+Non-Invasive+High-Frequency+Ultrasound+for+Computational+Fluid+Dynamics.">3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics.</a> Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).</li><li>Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Dynamics+and+Fluid+Dynamics+of+the+HH25+Chick+Embryonic+Cardiac+Ventricle+as+Revealed+by+a+Novel+4D+High-Frequency+Ultrasound+Imaging+Technique+and+Computational+Flow+Simulations.">Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2017).</li><li>Wasmeier, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+transthoracic+echocardiography+in+small+animals+using+clinical+equipment.">Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment.</a> Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).</li><li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+(2,6-diisopropylphenol)+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments.">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration. 4 (3), (2017).</li></ol>

Ecocardiografia no axolote e outras espécies não-mamíferos produz dados fundamentalmente diferentes do que a Ecocardiografia mamíferos devido à natureza nucleada das células vermelhas do sangue em todos os vertebrados exceto mamíferos adultos. Isso resulta em um sinal de sangue pronunciado e menos sangue-de-tecido contraste nas imagens ecocardiográficas axolote, em comparação com , por exemplo, mouse ou ecocardiografia humana. Isso pode dificultar segmentação de imagens em imagens de ultra-som não t...

Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte em todo o mundo1,2. Embora muitos sobrevivem a um infarto do miocárdio devido à intervenção médica rápida e aperfeiçoá-lo, incidentes isquêmicas em seres humanos, muitas vezes, levar a cicatrizes fibróticas associadas a hipertrofia, mau funcionamento elétrico e uma reduzida capacidade funcional do coração . Esta falta de potencial regenerativo do tecido cardíaco é compartilhada entre os mamíferos e embora controversas declarações de mamíferos regeneração cardíaca têm sido relatadas, estas foram limitadas ao cepas específicas de murino3,4 e ratos de hipóxia tratada5. Assim, o campo da biologia e medicina regenerativa cardíaca é geralmente limitado a modelos animais não-mamíferos para estudar fenômenos regenerativos intrínseca do coração. O peixe-zebra (Danio rerio) na última década foi estabelecido como o modelo mais bem caracterizado para coração intrínseca regeneração6,7,8,9,10 . Devido à manutenção do laboratório fácil, um tempo de geração curto e um vasto leque de ferramentas moleculares disponíveis, o zebrafish está bem adaptado como um modelo para mecanismos genéticos e moleculares subjacentes cardíaco desenvolvimento e regeneração. No entanto, as dimensões minutos do coração zebrafish torná-lo que menos adequado para a avaliação funcional e complicados procedimentos cirúrgicos e a não-tetrápode filogenia do zebrafish limita a extrapolação razoável das conclusões nesta espécie, assim justificando o uso de outros modelos maiores de tetrápodes. Um dos primeiros modelos de regeneração de coração de vertebrados foi um anfíbio caudado, o Tritão Oriental (Notophthalmus viridescens)11, uma espécie que continua a ser um modelo valioso12.
Nos últimos anos outro anfíbio caudado, o axolotl mexicano (a. mexicanum) entrou em cena como uma grande (até 100 g de corpo em massa) e altamente laboratório adaptável modelo animal para uma ampla gama de disciplinas regenerativas, abrangendo a regeneração de membro, lesão da medula espinhal e regeneração cardíaca13,14,15,16,17. O axolotl é altamente passível de medidas funcionais sobre o coração, usando a alta frequência ecocardiografia e ultra-som de imagem com um nível muito inferior de artefatos de imagem (acústicos permite a ausência de estruturas calcificadas no lado ventral do coração sombreamento e reverberação em particular) do que o observado em outros animais modelo com calcificada esterno e costelas.
O protocolo seguinte descreve vários métodos diferentes e preparações (Figura 1, Figura 2) para adquirir reprodutíveis ecocardiográficas medições no coração axolote em ambos anestesiados (aplicar três diferentes anestésicos: benzocaína, MS-222 e propofol) e sem anestesia animais em dois (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Arquivos complementares 1-12) e três (Figura 8, Figura 9, Arquivos complementares 13-14) dimensões espaciais. O coração dos anfíbios é três câmaras (dois átrios e um ventrículo único). Os átrios são fornecidos por um grande seio venoso e o ventrículo deságua o tracto de saída do conus arteriosus (Figura 2). Uma vez que mais ênfase é tradicionalmente colocado na regeneração ventricular e menos sobre a recuperação dos átrios6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, este protocolo centra-se principalmente em medições da função ventricular.
Ecocardiografia de anfíbios não é bem descrita na literatura, e o desenvolvimento dos métodos 2D descritas neste documento foram dirigidos pela necessidade de melhor representam a funcionalidade do coração batendo axolote em um determinado momento e configuração experimental. Assim, os métodos descritos aqui são aplicáveis em experiências regenerativas de coração onde função cardíaca pode ser monitorizada repetidamente ao longo de um processo de regeneração. Além disso, os métodos podem ser aplicados em experimentos de cardiophysiological sobre o axolote em geral ou ligeiramente modificados para abranger outros modelos de anfíbio caudados ou anfíbios anuros (e.g.,Xenopus). O axolote existe em várias cepas diferentes e variações de cor (por exemplo, sua, babão, branco, albino, branco transgénico com expressão de proteínas fluorescência verde), no entanto, estas características não afetar a compatibilidade do Ambystoma mexicanum com o protocolo descrito. O método descrito aqui para adquirir dados ecocardiográficos 3D é uma versão modificada da imagem spatiotemporal correlação (STIC) técnica desenvolvida por ultra-som clínico e a função quadrática média método descrito anteriormente no frango em desenvolvimento para aumentar o sinal de manchas de sangue em tecidos moles em espécies contendo hemácias nucleadas18,19. Este método permite a modelagem avançada de contração cardíaca e computada dinâmica de fluidos no coração axolote.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1230">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axolotl (Ambystoma mexicanum)</td>
			<td style="width:147px;">Exoterra GmbH</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td style="width:765px;">All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:147px;">Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td style="width:103px;">Vevo 2100</td>
			<td>High frequency ultrasound system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS700</td>
			<td style="width:147px;">Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td style="width:103px;">MS700</td>
			<td>50 MHz center frequency, transducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS550s</td>
			<td style="width:147px;">Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td>MS550s</td>
			<td>40 MHz center frequency, transducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzocain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94-09-7</td>
			<td>ethyl 4-aminobenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propofol</td>
			<td>B. Braun Medical A/S</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td>2,6-diisopropylphenol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">&#160;7647-14-5&#160;</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">10035-04-8</td>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">&#160;10034-99-8&#160;</td>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">&#160;7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">&#160;67-64-1&#160;</td>
			<td>Propanone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Soft cloth</td>
			<td style="width:147px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td>Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Styrofoam block</td>
			<td style="width:147px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td>Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:147px;">N/A</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td>Any piece of plastic wrap e.g. food wrap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tape</td>
			<td style="width:147px;">BSN Medical</td>
			<td style="width:103px;">72359-02</td>
			<td>Leukoplast sleek</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">Z188956&#160;</td>
			<td>Kimwipes, disposable wipers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:147px;">Microsoft</td>
			<td style="width:103px;">N/A</td>
			<td>Excel 2010 or newer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d echocardiography in the axolotl (ambystoma mexicanum)

Defeito cardíaco como resultado de doença isquêmica do coração é um grande desafio, e terapias regenerativas ao coração estão em alta demanda. Algumas espécies de modelo como zebrafish e salamandras que são capazes de regeneração intrínseca coração segura promessa futura das terapias regenerativas para pacientes humanos. Para avaliar o resultado das experiências de cardioregenerative, é imperativo que a função do coração pode ser monitorizada. A salamandra Ambystoma mexicanum (a. mexicanum) representa uma espécie de modelo bem estabelecida em biologia regenerativa atingir tamanhos que permite a avaliação da função cardíaca. O propósito do presente protocolo é estabelecer métodos para medir a função cardíaca nos axolotes usando ecocardiografia reproducibly. A aplicação de diferentes anestésicos (Benzocaína, MS-222 e propofol) é demonstrada, e a aquisição de dados de ecocardiográficas bidimensionais (2D) em axolotes anestesiados e sem anestesia é descrita. Ecocardiografia 2D do coração tridimensional (3D) pode sofrer de imprecisão e subjetividade das medições e para aliviar esse fenômeno um método sólido, ou seja análise intra/inter-operator/observador, para medir e minimizar esse viés é demonstrado. Finalmente, um método para adquirir dados ecocardiográficos 3D do coração axolote batendo em uma resolução muito alta spatiotemporal e com acentuado contraste de sangue-de-tecido é descrito. Globalmente, este protocolo deverá proporcionar os métodos necessários para avaliar a função cardíaca e anatomia do modelo e dinâmica nos axolotes utilizando imagens de ultra-som com aplicações em biologia regenerativa e experiências fisiológicas gerais de fluxo.

Espaço Intrapericárdica nos axolotes é dependente do tamanho do animal. Animais menores (2-20 g, 7-15 cm) terá um excesso de líquido pericárdico (aparecendo escuro em ecocardiografia) em torno que do cardíaco câmaras Considerando que em animais sexualmente maduros maiores (> 20 g, > 15 cm) as câmaras ocupará a maior parte do intrapericardial espaço. Para fornecer a melhor visão para resultados representativos de pontos de vista ecocardiográfica do coração axolote, um animal...

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2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Aqui apresentamos os protocolos de ecocardiografia para aquisição de imagens bidimensionais e tridimensionais do coração pulsante de salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), uma espécie de modelo na regeneração do coração. Estes métodos permitem a avaliação longitudinal da função cardíaca em uma alta resolução spatiotemporal.

Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo regenerativo, como como a regeneração cardíaca progride após a lesão do miocárdio. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece alta resolução, não invasiva e avaliação repetível da função cardíaca no axolotl. Além disso, esse método também pode ser aplicado a outros organismos modelo anfíbios, como newts e xenopus.Comece com o posicionamento de um supino axolotl anestesiado em um leito animal em forma de lábio. Quando o meio é adicionado, o animal flutuará, por isso deve ser protegido com elásticos soltos. Em seguida, encha a cama com anestésicos médios contendo para que o tórax esteja de três a cinco milímetros de profundidade.Se apenas usar o modo B, o modo Doppler de cor e os dados do modo Doppler de ondas de pulso, então o axolotl pode estar alerta para este procedimento. Nesta situação, posicione o animal propenso a uma rede, e deixe-o se recuperar do estresse por 30 a 60 minutos antes de prosseguir. Para animais brancos ou albinos, tenha uma fonte de luz fria pronta para ajudar a colocar o transdutor.Para um transdutor, use um modelo de 40 ou 50 hertz, dependendo da massa do animal. Em seguida, prepare o gel de ultrassom do transdutor e prossiga com a coleta de dados. Comece com o posicionamento do transdutor de ultrassom sobre a linha média do animal na região torácica, e paralelo ao seu longo eixo.Uma pequena porção do ventrículo, posicionada à direita na cavidade torácica, deve aparecer no quadro na diástola ventricular. Uma grande parte de ambos os atrias também devem ser visíveis, assim como o seio venoso. Essas estruturas devem ser identificáveis na vista de diastole ou systole.Em seguida, traduza o transdutor de um a três milímetros para a direita, para obter a visão ventricular de longo eixo. Em última análise, a posição correta é alcançada quando a área transversal do ventrículo de sístole final está no seu máximo. As medidas corretas de ultrassom 2D são altamente dependentes do posicionamento correto do transdutor.Pratique a colocação do transdutor meticulosamente e realize análises interoperadoras para minimizar a subjetividade. Agora, no modo B, adquira pelo menos três ciclos cardíacos a um mínimo de 50 quadros por segundo. Escolha entre usar o modo geral de imagem ou o modo de cardiologia.Em seguida, traduza o transdutor ao longo do longo eixo do animal até que o centro do ventrículo esteja no meio da tela. Em seguida, gire o transdutor 90 graus no sentido horário para obter a visão do eixo curto midventricular. A partir desta posição, avalie a forma circular do ventrículo traduzindo o transdutor ao longo do longo eixo do coração.Em seguida, devolva o transdutor ao plano de eixo longo, e traduza-o de volta para a linha média para obter uma visão atrial de dois eixos longos. A posição correta é alcançada quando as áreas transversais da atria de sístole final estão em sua máxima, e os dois atria combinados assumem o contorno do número oito quando inclinados cerca de 45 graus para a esquerda. Em seguida, colete imagens no modo B.Para prosseguir, traduza o transdutor para a direita até que o trato de saída apareça. A visão ventricular de systole final está correta quando o diâmetro da saída está no seu maior, e quando, durante a injeção média, duas das válvulas semiluminares, na entrada do fluxo de saída, são visíveis. A partir desta visão, as medições de velocidade e fluxo podem ser feitas usando imagens doPpler.Aplique o modo color-Doppler para mapear as velocidades de fluxo sanguíneo no trato de saída durante a injeção cardíaca. Em seguida, aplique imagens doppler de cor e imagens doppler de energia para visualizar o fluxo sanguíneo na visão ventricular, e faça o mesmo na visão atrial. Em seguida, use o modo Color-Doppler direcionado para a localização da velocidade máxima do sangue no trato de saída que corre diretamente em direção ao transdutor.Quando a saída não estiver completamente perpendicular ao transdutor, aplique um ângulo de feixe e correção angular para corrigir a imagem em até 45 graus. Em seguida, colete dados de tempo de velocidade no modo Doppler de onda de pulso. Durante nenhuma fase do ciclo cardíaco, a válvula espiral se sobrepõe à visão da saída.Colete dados de pelo menos três ciclos cardíacos. Em seguida, sem mover o transdutor, adquira dados no modo B a partir de pelo menos três ciclos cardíacos. Em seguida, apenas para animais anestesiados, gire o animal 90 graus para que a parte certa do animal esteja voltada para cima, e mova o transdutor para a vista oblíqua para-brânquia, apenas paralela e posterior às brânquias salientes.Esta visão oferece uma medição alternativa da velocidade de fluxo sanguíneo no trato de saída. O trato de saída deve estar correndo para baixo em cerca de 45 graus, e o atria deve aparecer sob o trato de saída durante a injeção. Finalmente, mude para o modo Doppler de onda de pulso e posicione o transdutor para ver a velocidade máxima do sangue fugindo do transdutor no trato de saída.Conforme necessário, use até 45 graus de ângulo de feixe e correção angular para tornar a saída perpendicular ao transdutor. Em seguida, colete dados no modo Doppler de ondas de pulso e no modo B a partir da mesma posição de antes. A aquisição 3D leva um tempo, então o axololo deve ser anestesiado.Coloque-o supino na cama animal em forma de lábio. Fixá-lo com elásticos, e submergir sua superfície torácica em três a cinco milímetros de meio de ultrassom contendo um anestésico. Os movimentos durante a aquisição 3D são prejudiciais para a reconstrução subsequente.Se o animal se mover durante a aquisição do ultrassom 3D, o procedimento deve ser repetido desde o início. Em seguida, posicione o transdutor sobre a linha média na região torácica, e coloque-o paralelo ao eixo longo para uma gravação 3D sagital, ou ortogonal ao eixo longo para gravação 3D transversal. Em seguida, traduza o transdutor para garantir que toda a região cardíaca fique coberta na captura 3D subsequente.Mova-o tanto na dimensão do plano quanto na dimensão fora do avião. Para o modo de imagem, se a frequência cardíaca do animal estiver entre 20 e 60 batimentos por minuto, selecione o modo geral de imagem. Caso contrário, escolha o modo de cardiologia.Desligue a luz. Agora, na imagem bruta do modo B, ajuste o ganho 2D a um nível onde as estruturas anatômicas são pouco reconhecíveis. Isso aumentará a relação sinal-ruído nas reconstruções finais.Em seguida, decida o tamanho da espessura do passo Z ou da fatia. Agora, traduza o transdutor um passo Z de cada vez, fazendo uma gravação contendo 1.000 quadros em cada passo Z até que toda a região cardíaca tenha sido coberta. Uma análise ecocardiográfica 2D de um axolotl de 10 gramas e 10 centímetros foi realizada utilizando-se a técnica descrita.A visão de eixo longo proporcionou um bom ponto de partida. O plano médio mostrou o seio venoso, atria e partes do ventrículo. A visualização do plano ventricular mostrou que o ventrículo era esférico e altamente trabeculado.No plano atrial, o atria parecia mais irregular e mal trabeculado. O centro do trato de saída está próximo ao centro do ventrículo. Medições do ciclo cardíaco usando doppler de ondas de pulso do eixo longo e do plano para-brânquio oblíquo tiveram algum ruído de fundo.Este ruído era superável ao fazer medições do tempo de velocidade integral. Color-Doppler e imagem power-Doppler mostraram o padrão de fluxo através das câmaras cardíacas. As vistas eram possíveis a partir do ventrículo, do atria, e do trato de saída.A ecocardiografia 3D também foi realizada. Essa visão multiplanar do coração tem muitos usos, como reconstruções de superfície e volume, ou segmentação e geração de modelos 3D. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a ecocardiografia 2D e 3D no axolotl.Uma vez dominada, a técnica de ultrassom 2D pode ser feita em menos de cinco minutos por animal, se for realizada corretamente, enquanto a aquisição 3D pode levar até uma hora por animal. Após este procedimento, outros métodos como extração cardíaca e histologia podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais relacionadas à estrutura cardíaca e anatomia.

Research

JoVE Journal

Medicine

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Transthoracic Echocardiography in Mice

Ecocardiografia transtorácica em Ratos

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Medicina

High-frequency High-resolution Echocardiography: First Evidence on Non-invasive Repeated Measure of Myocardial Strain, Contractility, and Mitral Regurgitation in the Ischemia-reperfused Murine Heart

De alta freqüência Ecocardiografia de alta resolução: primeira evidência de não-invasivos Medida repetida de Strain miocárdico, contratilidade, e regurgitação mitral no coração Isquemia-reperfundidos murino

Ischemia-reperfusion (IR) was surgically performed in murine hearts which were then subjected to repeated imaging to monitor temporal changes in ...

Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging

Ecocardiografia murino e ultra-sonografia

Rodent models of cardiac pathophysiology represent a valuable research tool to investigate mechanism of disease as well as test new therapeutics.1  ...

Murine Fetal Echocardiography

Ecocardiografia Fetal murino

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Ecocardiografia fetal e ultra-som Doppler pulsátil em um modelo de coelho de restrição do crescimento intra-uterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

A Whole Body Dosimetry Protocol for Peptide-Receptor Radionuclide Therapy (PRRT): 2D Planar Image and Hybrid 2D+3D SPECT/CT Image Methods

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Um protocolo de dosimetria corporal inteira para terapia de radionuclídeo peptídeo-receptor (PRRT): imagem planar 2D e métodos híbridos de imagem 2D+3D SPECT/CT

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Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

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