Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

ونحن نشكر ليو يو جيم لعمله المبكر على إنتاج Tlp3-الإعلان. مايرا ألف ماتشوكا مدين ل Departamento أدميستراتيفو دي العلوم، التكنولوجيا الإلكترونية معهد Innovación للحصول على منحة دكتوراه.

1-التعبير عن بلده6-Tlp3-الإعلان في كولاي
<ol><li>تلقيح 150 مل مرق لوريا بيرتاني (رطل) العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين مع BL21 كودون-زائد (DE3)-RIPL الخلايا تتحول مع ناقل pET151/د-توبو للتعبير عن بلده6-Tlp3-قام (مخلفات الأحماض الأمينية 42-291)، و احتضان أنه عند 37 درجة مئوية...

ويرد إجراء بسيط للتعبير وريفولدينج من إدراج الهيئات قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور الجرثومي Tlp3. إعداد البروتين النقي ينطوي التعبير المفرط عن الجينات بلازميد المرمزة الحيوانات الأليفة في كولايوتنقيتها وسولوبيليسيشن لإدراج الهيئات، ريفولدينج البروتين التشويه والتحريف وتنقية وا...

إنزيمية وحركية قد أظهرت أن تلعب أدواراً هامة في إمراضية والعطيفه الصائمية بتشجيع الاستعمار الجرثومي وغزو من المضيف2،،من13. يسمح به البكتيريا للتحرك نحو بيئة أفضل للنمو، كما يسترشد بالإشارات الكيميائية. تنطوي هذه العملية على الاعتراف بالإشارات الكيميائية داخل الخلايا والبيئة بمجموعة من البروتينات يسمى تشيموريسيبتورس، أو محول الطاقة مثل البروتينات (قوة). تشيموريسيبتورس معظم هي جزءا لا يتجزأ من غشاء بروتينات مع يجند اكستراسيتوبلاسميك ملزمة المجال (الإعلان) وفي مجال ترانسميمبراني وفي مجال التنبيه هيولى، هذه الأخيرة التي تتفاعل مع البروتينات التنبيه سيتوسوليك التي ترسل إشارة أن المحركات فلاجلر4،5،،من67.
تم تحديد أحد عشر تشيموريسيبتورس مختلفة في4،الجينوم الصائمية جيم- 8. وحتى الآن، سوى بعض من هذه تشيموريسيبتورس وصفت وهو معروف خصوصية يجند Tlp19و10،Tlp311، Tlp411، Tlp712، و Tlp1113 . تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس المتبقية في هذه الأنواع، والعديد من تشيموريسيبتورس في البكتيريا الأخرى، يمكن أن يتيسر إلى حد كبير بإنتاج مطوية ونقية جداً المؤتلف تشيموريسيبتور، لبدس14 15 , 16-بيد أن محاولات للتعبير عن هيتيرولوجوسلي لبدس بيريبلاسميك من تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية غالباً ما يؤدي في استهدافها في الهيئات إدراج17،18،19 . ومع ذلك، يمكن تسهيل هذه الظاهرة العزلة سهلة والانتعاش من البروتين في متناول اليد. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور جيم الصائمية Tlp3 كمثال. وقد اختير هذا المثال للإعلان Tlp3 ينتمي إلى الأسرة dCACHE20 من مجالات الاستشعار التي توجد وفرة في مؤنزم الحامض الأميني مكون اثنين وتشيموريسيبتورس في بدائيات النوى20،21، 22 , 23.
في هذا النهج، تم تصميم بنية التعبير، استناداً إلى ناقل pET151/د-توبو، إلى إدراج ن--المحطة طرفية له6-العلامة متبوعاً التبغ أحفر موقع الانقسام مبطلات الفيروس (TEV)، ل إزالة العلامة اللاحقة19. ويصف البروتوكول overexpression البروتين في كولاي، والعزلة، واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، والبروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا. بعد ريفولدينج، هو تنقية العينة بالتقارب اللوني، مع علامة اختياري إزالة وحجم الاستبعاد اللوني. ويؤكد الدولة مطوية من البروتين المنقي باستخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية. هذا هو نسخة معدلة من الأسلوب الذي تم وضعه مسبقاً لاسترداد وتنقية قام تشيموريسيبتور المختلفة، الملوية البوابية تلبك19. غلة هذا الإجراء، تلخص في الشكل 1، 10-20 ملغ قام Tlp3 نقية، وليس تمييز كل 1 لتر ثقافة البكتيرية، بدرجة نقاء بروتين من > 90% حسب تقديرات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

ويمكن تسهيل تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس ودراسات هيكلية تهدف إلى توضيح الأساس الجزيئي لخصوصية يجند إلى حد كبير بإنتاج كميات مليغرام من المجالات ملزم يجند نقية، مطوية. محاولات هيتيرولوجوسلي التعبير عن مجالات ملزم يجند بيريبلاسميك تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية (كولاي) غالباً ما يسفر عن استهدافهم في الهيئات المعنية بإدراج. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام المجال ملزم يجند من العطيفة الصائمية (C. الصائمية) تشيموريسيبتور Tlp3 dCACHE بيريبلاسميك كمثال. هذا النهج ينطوي على التعبير عن البروتين يحظى باهتمام كليفابل له6-الوسم، والعزلة واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، بروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا، وتنقية عن طريق التقارب اللوني، متبوعاً بعلامة الإزالة وحجم الاستبعاد اللوني. يتم استخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية لتأكيد الدولة مطوية من البروتين النقي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول عموما مفيد لإنتاج كميات مليغرام dCACHE يجند بيريبلاسميك ربط مجالات أخرى تشيموريسيبتورس البكتيرية في نموذج قابل للذوبان وكريستاليسابل.

التعبير المؤتلف له6-Tlp3-الإعلان في كولاي أدى إلى ترسب البروتين في إدراج الهيئات. العائد التعبير من 1 لتر ثقافة البكتيرية المحسوبة في الخطوة 2، 13 كان حوالي 100 ملغ من بلده6-Tlp3-قام المودعة في إدراج الهيئات. إجراءات عزل البروتين، الموصوفة هنا وهو موضح في <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

ويرد إجراء ريفولدينج مجال ملزم يجند بيريبلاسميك dCACHE chemoreceptor والعطيفه الصائمية Tlp3 من إدراج الهيئات وتنقية تؤتي مليغرام كميات من البروتين.

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...