Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Vi takker Yu C. Liu for sit tidlige arbejde med Tlp3-LBD produktion. Mayra A. Machuca står i gæld til lejlighed Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS for et ph.d.-stipendium.

1. angivelse af hans6-Tlp3-LBD i E. coli
<ol><li>Podes 150 mL i sterile Luria-Bertani (LB) bouillon indeholdende 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL celler omdannet med pET151/D-TOPO vektor for udtryk for hans6- Tlp3-LBD (aminosyrerester 42-291), og Inkuber det ved 37 ° C i en shaker (orbit diameter, 25 mm) med 200 rpm natten over.</li>
	<li>Forberede seks 2 L Erlenmeyerkolben kolber indeholdende 800 mL sterilt LB bouillon og 50 µg mL-1 ampicill...

En enkel procedure for udtryk og hvorved man genfolder optagelse ligene af den bakterielle chemoreceptor Tlp3 periplasmic LBD er præsenteret. Forberedelse af ren protein indebærer overdreven udtryk for pET-plasmid-kodede genet i E. coli, rensning og opløsning af inklusion organer, hvorved man genfolder af den denaturerede proteiner og dets rensning af de på hinanden følgende affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi trin. Urea-faciliteret denaturering og fortynding/dialyse-medieret hvorved man genfol...

Chemotaxis og motilitet har vist sig at spille en vigtig rolle i Campylobacter jejuni patogenesen ved at fremme bakteriel kolonisering og invasion af vært1,2,3. Chemotaxis giver mulighed for bakterier til at gå i retning af et optimalt miljø for vækst, som styres af kemiske signaler. Denne proces indebærer anerkendelse af intracellulære og miljømæssig kemiske signaler ved et sæt af proteiner kaldes chemoreceptors eller transducer-lignende proteiner (Tlps). De fleste chemoreceptors er membran-embedded proteiner med en extracytoplasmic ligand bindende domæne (LBD), en transmembrane domæne og et cytoplasmatisk signalsystemer domæne, hvor sidstnævnte interagerer med de cytosole signalsystemer proteiner, der sender signalet til flagellaternes motors4,5,6,7.
Elleve forskellige chemoreceptors er blevet identificeret i C. jejuni genom4,8. Til dato, kun nogle af disse chemoreceptors har været præget og ligand specificiteten af Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, og Tlp1113 er kendt. Identifikation af naturlige ligander af de resterende chemoreceptors i denne art, og talrige chemoreceptors i andre bakterier, kan lettes meget af produktionen af foldede og meget ren rekombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. imidlertid forsøg på at heterologously express periplasmic LBDs af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli ofte resultere i deres målretning i inklusion organer17,18,19 . Ikke desto mindre kan dette fænomen lette let isolation og inddrivelse af protein i hånden. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af den periplasmic LBD af C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som eksempel. I dette eksempel blev valgt, fordi Tlp3-LBD tilhører dCACHE familien20 af sensing domæner, som findes talrigt i to-komponent histidin kinaser og chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.
I denne tilgang, udtryk konstruktion, baseret på en pET151/D-TOPO vektor, har været udviklet til at inkorporere en N-terminale hans6-tag efterfulgt af en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang site, for efterfølgende tag fjernelse19. Protokollen beskriver protein overekspression i E. coli, isolation og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, og protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding. Efter, hvorved man genfolder, prøven er renset af affinitet kromatografi, med valgfri tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Foldede staten af oprenset protein er bekræftet ved hjælp af cirkulære dichroism spektroskopi. Dette er en modificeret udgave af den metode, der tidligere er udviklet til at restituere sig og rense LBD af en anden chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Denne procedure, sammenfattet i figur 1, udbytter 10-20 mg ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriekultur, med protein renhed > 90% som anslået af SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Identifikation af naturlige ligander chemoreceptors og strukturelle undersøgelser med henblik på udredning af det molekylære grundlag af ligand specificitet kan lettes meget af produktionen af milligram beløb af ren, foldede ligand bindende domæner. Forsøg på at heterologously express periplasmic ligand bindende domæner af bakteriel chemoreceptors i Escherichia coli (E. coli) ofte resultere i deres målretning i inklusion organer. Her præsenteres en metode for protein recovery fra inklusion organer, hvorved man genfolder og rensning, ved hjælp af periplasmic dCACHE ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som eksempel. Metoden indebærer udtryk for protein af interesse med en cleavable hans6-tag, isolering og urinstof-medieret opløsning af inklusion organer, protein, hvorved man genfolder af urinstof udtynding og rensning ved affinitet kromatografi, efterfulgt af tag fjernelse og størrelse-udelukkelse kromatografi. Cirkulær dichroism spektroskopi bruges til at bekræfte den foldede tilstand af ren protein. Det er blevet påvist, at denne protokol er generelt nyttigt for produktion af milligram mængder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæner af andre bakterielle chemoreceptors i en opløselig og crystallisable form.

Rekombinant udtryk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterede i protein deposition i inklusion organer. Udtrykket udbyttet fra 1 L af bakteriekulturen beregnet i trin 2.13 var ca. 100 mg hans6-Tlp3-LBD deponeret i inklusion organer. Protein isolation procedure, beskrevet her og illustreret i figur 1, består af opløsning af inklusion organer, hvorved man genfolder protein og rensning, affinitet kromatografi, tag fjernelse og stø...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

En procedure er præsenteret for hvorved man genfolder af dCACHE periplasmic ligand bindende domæne af Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 fra inklusion organer og rensning at give milligram mængde af protein.

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metode til syntese af Peptoider med Blandet lysin-type / Arginin-type monomerer og evaluering af deres anti-Leishmania aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metode til at bestemme dissociationskonstant Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Effektiv rensning og LC-MS/MS-baseret analyse udvikling for ti-elleve omplantning-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur af den N-terminale domæne af ryanodinreceptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...