Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

אנו מודים ליו יו ג על עבודותיו המוקדמות ההפקה Tlp3-LBD. עורכת דין אחינעם אורבך א מצ'וקה הוא מחויב המחלקה הבינלאומית Admistrativo דה Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS עבור מלגת הדוקטורט.

1. ביטוי של שלו6-Tlp3-LBD ב e. coli
<ol><li>לחסן 150 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) סטרילי המכיל אמפיצילין-1 מ"ל µg 50 עם BL21-Codon-פלוס (DE3) - תאים RIPL הפך עם וקטור pET151/D-טופוגרפיה להבעה של שלו6- Tlp3-LBD (חומצת אמינו שאריות 42-291), ו דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר (קוטר אורביט, 25 מ מ) עם סל"ד 200 בן לילה.</li>
	<li>ל?...

הליך פשוט ביטוי, refolding מגופים הכללה של LBD periplasmic של chemoreceptor חיידקי Tlp3 מוצג. הכנה של החלבון הטהור כרוך ביטוי יתר של הגן חיות מחמד פלסמיד-מקודד ב e. coli, טיהור, solubilisation של גופים הכללה, refolding של החלבון denatured, טיהור שלה על ידי בזיקה רצופים ו גודל-הדרה כרומטוגרפיה צעדים. הקלו אוריאה דנטורציה של דיל...

כימוטקסיס, תנועתיות הוכחו תפקיד חשוב בפתוגנזה קמפילובקטר jejuni באמצעות קידום colonisation חיידקי ופלישה של מארח1,2,3. כימוטקסיס מאפשרת לחיידקים לנוע לעבר סביבה אופטימלית עבור הצמיחה, המונחית על ידי אותות כימיים. תהליך זה דורש הכרה תאיים וסביבתיים סימנים כימיים על ידי קבוצה של חלבונים כינה chemoreceptors, או חלבונים דמויי מתמר (הניתוח). רוב chemoreceptors הם חלבונים ממברנה-מוטבע עם ליגנד extracytoplasmic מחייב תחום (LBD), תחום transmembrane, תחום האיתות cytoplasmic, הצופות על אינטראקציה עם החלבונים האיתות cytosolic המעבירים את האות מנועים השוטוניים4,5,6,7.
11 chemoreceptors שונים זוהו ב4,הגנום ג jejuni 8. עד כה, רק חלק chemoreceptors האלה יש אפיינה וידוע יחודיות ליגנד של Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712Tlp1113 . זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors הנותרים של מין זה, chemoreceptors רבים של חיידקים אחרים, ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של chemoreceptor רקומביננטי, מקופל וטהור מאוד LBDs14, 15 , 16. עם זאת, ניסיונות להביע heterologously את LBDs periplasmic של chemoreceptors חיידקי ב- Escherichia coli , לעיתים קרובות לגרום שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה17,18,19 . למרות זאת, תופעה זו יכולה להקל על קל בידוד ושחזור של החלבון ביד. כאן, שיטה מוצג שחזור חלבון מגופים הכללה, refolding, טיהור, כדוגמא את LBD periplasmic של chemoreceptor ג jejuni Tlp3. דוגמה זו נבחרה משום Tlp3-LBD שייך משפחתי dCACHE20 של תחומים חישה המצויים בשפע שני היסטידין kinases ו chemoreceptors אאוקריוטים20,21, 22 , 23.
בגישה זו, הביטוי הבונה, בהתבסס על וקטור pET151/D-טופו, תוכנן לשלב N-מסוף שלו6-תג ואחריו טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף באתר, לקבלת תג עוקבות הסרת19. הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון ב e. coli, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של הכללה, וגופי חלבון refolding על ידי דלדול אוריאה. בעקבות refolding, המדגם מטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה עם כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג אופציונלי. המדינה מקופלת של החלבון מזוכך הוא אישר באמצעות קיווטות ספקטרוסקופיה. זה גירסה שונה של השיטה פותחה בעבר כדי לשחזר ולטהר את LBD של chemoreceptor שונים, הליקובקטר פילורי TlpC19. הליך זה, המסוכם איור 1, מניב 10-20 מ"ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי, עם חלבון טוהר > 90% כפי שנאמדו על ידי עמודים מרחביות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors ומחקרים מבניים מכוון הבהרה של הבסיס המולקולרי של ליגנד יחודיות ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של כמויות מיליגרם של ליגנד טהור, מקופל מחייב תחומים. ניסיונות heterologously אקספרס ליגנד periplasmic דומיינים איגוד של חיידקי chemoreceptors ב Escherichia coli (e. coli) לעיתים קרובות התוצאה שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה. . הנה, שיטה מוצג להתאוששות חלבון הכללה גופות, שלה refolding, טיהור, המחשבים איגוד ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni (ג jejuni) chemoreceptor Tlp3 כדוגמא. הגישה כרוך הביטוי של החלבון עניין עם cleavable שלו6-תג, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding על ידי דלדול שתנן, טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ואחריו כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג. ספקטרוסקופיית קיווטות משמש כדי לאשר במצב מקופל של החלבון הטהור. זה הוכח, פרוטוקול זה שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מיליגרם של dCACHE ליגנד periplasmic מחייב תחומים של אחרים chemoreceptors חיידקי בטופס מסיסים ו crystallisable.

ביטוי רקומביננטי שלו6-Tlp3-LBD ב e. coli , גרמו בעדות חלבון בגוף הכללה. התשואה ביטוי של 1 ליטר של התרבות חיידקי שחושבו בצעד 2.13 היתה כ- 100 מ ג של שלו6-Tlp3-LBD שהופקד בגופים הכללה. ההליך בידוד חלבון, המתוארים כאן, מאויר איור 1, מורכב solubilisation של גופים הכללה, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...