Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
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हम Tlp3-LBD उत्पादन पर अपने शुरुआती काम के लिए यू सी लियू धंयवाद । मायरा ए. Machuca डॉक्टरी छात्रवृत्ति के लिए Departamento Admistrativo डे Ciencia, Tecnología ई Innovación COLCIENCIAS का ऋणी है ।

1. ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD की अभिव्यक्ति
<ol><li>Inoculate १५० मिलीलीटर बाँझ Luria-Bertani (LB) शोरबा युक्त ५० µ g mL-1 एम्पीसिलीन with BL21-Codon-Plus (DE3)-RIPL कोशिकाओं pET151/डी-टोपो वेक्टर अपने6-Tlp3-LBD (एमिनो एसिड अवशेषों 42-291) की अभिव्यक्त?...

अभिव्यक्ति के लिए एक सरल प्रक्रिया और बैक्टीरियल chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD के शामिल निकायों से गुना प्रस्तुत किया है । शुद्ध प्रोटीन की तैयारी से अधिक की अभिव्यक्ति शामिल है पीईटी-प्लाज्मिड-एनकोडेड जीन में ई....

Chemotaxis और गतिशीलता को होस्ट1,2,3के बैक्टीरियल रोगजनन और आक्रमण को बढ़ावा देकर कैम्पिलोबैक्टर jejuni colonisation में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते दिखाया गया है । Chemotaxis बैक्टीरिया विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण की ओर जाने के लिए अनुमति देता है, के रूप में रासायनिक संकेतों द्वारा निर्देशित । इस प्रक्रिया में प्रोटीन का एक सेट chemoreceptors, या transducer की तरह प्रोटीन (Tlps) के द्वारा intracellular और पर्यावरणीय रासायनिक संकेतों की मांयता शामिल है । अधिकांश chemoreceptors एक extracytoplasmic ligand बाइंडिंग डोमेन (LBD), एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic संकेत डोमेन के साथ झिल्ली-एंबेडेड प्रोटीन होते हैं, जिसके बाद संकेत संचारित करने वाले cytosolic संकेत प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है को flagellar मोटर्स4,5,6,7।
ग्यारह विभिन्न chemoreceptors की पहचान सी. jejuni जीनोम4,8में की गई है । तारीख करने के लिए, इन chemoreceptors के केवल कुछ विशेषता है और Tlp1 के ligand विशिष्टता9, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, और Tlp1113 है जाना जाता है । इस प्रजाति में शेष chemoreceptors के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, और अन्य जीवाणुओं में कई chemoreceptors, तह और अत्यधिक शुद्ध रिकॉमबिनेंट chemoreceptor LBDs14के उत्पादन द्वारा बहुत सुविधा हो सकती है, 15 , 16. हालांकि, heterologously एक्सप्रेस periplasmic LBDs में बैक्टीरियल chemoreceptors के प्रयास ई कोलाई में अक्सर परिणाम को शामिल करने के निकायों में उनके लक्ष्यीकरण में17,18,19 . फिर भी, इस घटना आसान अलगाव और हाथ में प्रोटीन की वसूली की सुविधा कर सकते हैं । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया है, इसका खुलासा और शुद्धि, एक उदाहरण के रूप में ग. jejuni chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD का उपयोग कर । इस उदाहरण चुना गया था क्योंकि Tlp3-LBD संवेदन डोमेन के dCACHE परिवार20 के अंतर्गत आता है जो बहुतायत से दो घटक histidine kinases और chemoreceptors में prokaryotes20,21में पाया जाता है, 22 , 23.
इस दृष्टिकोण में, अभिव्यक्ति का निर्माण, एक pET151/D-टोपो वेक्टर के आधार पर, एक N-टर्मिनल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है6-एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) के बाद टैग को छेड़ो दरार साइट, बाद में टैग हटाने के लिए19। प्रोटोकॉल ई. कोलाई, अलगाव और यूरिया-शामिल किए जाने वाले निकायों के मध्यस्थता solubilisation में प्रोटीन की कमी का वर्णन है, और प्रोटीन यूरिया घट द्वारा पुनः प्रकट । बाद में, नमूना अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है, वैकल्पिक टैग को हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ । शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पुष्टि की है । इस विधि का एक संशोधित संस्करण है कि पहले से ठीक है और एक अलग chemoreceptor, Helicobacter हेलिकोबेक्टर TlpC19के LBD शुद्ध विकसित किया गया है । यह प्रक्रिया, चित्रा 1में संक्षिप्त, पैदावार 10-20 शुद्ध, untagged Tlp3-LBD प्रति 1 बैक्टीरियल संस्कृति के एल, के एक प्रोटीन शुद्धता के साथ > 90% के रूप में एसडीएस द्वारा अनुमानित-पृष्ठ ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

ligand विशिष्टता के आणविक आधार के elucidation के उद्देश्य से chemoreceptors और संरचनात्मक अध्ययन के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, शुद्ध, जोड़ मिलीग्राम बाइंडिंग डोमेन के ligand मात्रा के उत्पादन के द्वारा काफी सुविधा हो सकती है । ई कोलाई (ई. कोलाई) में बैक्टीरियल chemoreceptors की एक्सप्रेस periplasmic ligand बंधन डोमेन heterologously करने के लिए प्रयास अक्सर शामिल निकायों में अपने लक्ष्यीकरण में परिणाम । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया जाता है, इसका खुलासा और शुद्धि, periplasmic dCACHE ligand बाइंडिंग डोमेन का उपयोग कर कैम्पिलोबैक्टर jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 एक उदाहरण के रूप में । दृष्टिकोण एक सट अपने6टैग, अलगाव और यूरिया के साथ ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल निकायों के मध्यस्थता solubilisation, यूरिया कमी के द्वारा पुनः प्रकट प्रोटीन, और समानता के माध्यम से शुद्धि क्रोमैटोग्राफी, टैग हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया । परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इस प्रोटोकॉल आम तौर पर एक घुलनशील और chemoreceptors रूप में अंय जीवाणु crystallisable के dCACHE periplasmic ligand बाध्यकारी डोमेन के मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए उपयोगी है ।

ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD के रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति शामिल निकायों में प्रोटीन जमाव के परिणामस्वरूप । 1 एल से अभिव्यक्ति की उपज बैक्टीरियल संस्कृति के चरण २.१३ में गणना की लगभग १०० मिलीग...

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Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

एक प्रक्रिया को शामिल निकायों से dCACHE periplasmic ligand बंधन डोमेन के कैम्पिलोबैक्टर jejuni chemoreceptor Tlp3 का खुलासा करने के लिए प्रस्तुत किया है और शुद्धि के लिए प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा उपज ।

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

मिश्रित लाइसिन प्रकार / Arginine प्रकार monomers और उनके विरोधी leishmanial गतिविधि के मूल्यांकन के साथ peptoids के संश्लेषण के लिए एक कारगर तरीका

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

मात्रात्मक Transcriptome विश्लेषण में उपयोग के लिए बीज से उच्च शुद्ध शाही सेना के अलगाव के लिए एक कारगर तरीका

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

कुशल शुद्धि और नियंत्रण रेखा-ms/दस के लिए परख विकास आधारित-ग्यारह Translocation-२ ५-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellular प्रोटीन Microarray कम संबध रिसेप्टर का उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी-Ligand बातचीत

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

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एन के क्रिस्टल संरचना-टर्मिनल डोमेन के Ryanodine रिसेप्टर से Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...