Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
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우리는 그의 초기 작품 Tlp3 LBD 생산에 대 한 유 C. Liu를 감사합니다. Mayra A. Machuca 딸 Admistrativo 데 많은, 기술과 전자 Innovación COLCIENCIAS 박사 장학금에 대 한 빚을입니다.

1. 표현의 그의6-Tlp3- 대장균 에 LBD
<ol><li>50 µ g mL-1 암 피 실린 BL21 Codon 플러스 (DE3)를 포함 하는 메 마른 Luria Bertani (파운드) 국물의 150 mL 접종-RIPL 셀 그의6의 표현에 대 한 pET151/D-이동 벡터와 변형-Tlp3-LBD (아미노산 잔류물 42-291), 그리고 품 어 그것 통 (궤도 직경, 25 m m)에 37 ° C에서 200 rpm으로 하룻밤.</li>
	<li>포함 하는 살 균 파운드 국물과 50 µ g mL-1 암 피 실?...

식 및 세균성 chemoreceptor Tlp3의 periplasmic LBD의 포함 시체에서 refolding 간단한 절차 제공 됩니다. 순수 단백질의 준비- 대장균, 정화 및 포함 시체, solubilisation 애완 동물 플라스 미드 인코딩 유전자 표현 포함 연속 선호도 의해 변성된 단백질의 정화의 refolding 및 크기 배제 크로마토그래피 단계입니다. 촉진 하는 요소 변성 및 refolding 희석/투 석-중재 최적화는 종종 포함 시체26?...

Chemotaxis 및 운동 성 세균성 식민 및 호스트1,2,3의 내 습을 홍보 함으로써 Campylobacter jejuni 병 인에 중요 한 역할을 보여왔다. 화학 신호에 의해 유도 chemotaxis 박테리아를 성장 위한 최적의 환경으로 이동할 수 있습니다. 이 프로세스는 불린다 chemoreceptors, 단백질 또는 트랜스듀서와 같은 단백질 (Tlps)의 집합에 의해 세포내 및 환경 화학 신호의 인식 포함 됩니다. 대부분 chemoreceptors는 바인딩 도메인 (LBD), 막 횡단 도메인 및 세포질 신호 도메인, 후자는 신호를 전송 하는 신호 cytosolic 단백질 상호 작용 하는 extracytoplasmic ligand 단백질 막 포함 하는 flagellar 모터4,5,,67.
11 다른 chemoreceptors C. jejuni 게놈4,8에서 확인 되었습니다. 날짜 하려면, 이러한 chemoreceptors의 일부 특징 되어 있다 그리고 Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, Tlp1113 의 리간드 특이 알려져 있다. 이 종에서 나머지 chemoreceptors 그리고 다른 박테리아에 수많은 chemoreceptors의 자연 ligands의 접힌 및 매우 순수한 재조합 chemoreceptor LBDs14, 의 생산에 의해 크게 촉진 될 수 있다 15 , 그러나 16., heterologously 대장균 세균성 chemoreceptors의 periplasmic LBDs를 자주 표현 하려고 포함 시체17,18,19로 그들의 대상으로 발생 . 그럼에도 불구 하 고,이 현상을 수 용이 하 게 쉬운 격리 및 복구 단백질의 손에. 여기, 메서드 포함 시체에서 단백질 복구, refolding와 정화, 예를 들어 periplasmic LBD의 C. jejuni chemoreceptor Tlp3 사용 하 여 제공 됩니다. 이 예제에서는 Tlp3 LBD 풍부 하 게 2 분 히스티딘 kinases와 원핵생물20,21, chemoreceptors에 있는 감지 영역의 dCACHE 가족20 에 속하기 때문에 선정 되었다 22 , 23.
이 방법에서는, pET151/D-이동 벡터에 따라 식 구문 통합 N 맨끝 그의6설계 되었습니다-태그 뒤에 담배 엣지 후속 태그 제거19에 대 한 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. 프로토콜은 단백질 overexpression을 대장균, 격리 및 포함 몸과 요소 고갈에 의해 refolding 단백질의 solubilisation 중재 하는 요소에 설명 합니다. Refolding, 다음 샘플은 선택적 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피와 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하 고 있다. 순화 된 단백질의 접힌된 상태는 원형이 색 성 분광학을 사용 하 여 확인 됩니다. 이것은 이전 복구 하 고 다른 chemoreceptor, 헬리코박터 파일로리 TlpC19의 LBD 정화 개발 된 방법의 수정 된 버전. 이 절차는 그림 1에서 요약의 단백질 순수성을 가진 세균성 문화의 1 L 당 순수 하 고, 태그 Tlp3 LBD의 10-20 밀리 그램 생성 > 90 %SDS 페이지 예상된.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Chemoreceptors와 겨냥 한 ligand 특이성의 분자 기준의 구조 연구의 자연 ligands의 밀리 그램 양의 순수 하 고, 접힌 ligand 바인딩 도메인의 생산에 의해 크게 촉진 수 있습니다. Heterologously의 대장균 (대장균) 박테리아 chemoreceptors periplasmic ligand 바인딩 도메인을 자주 표현 하려고 포함 시체에 그들의 타겟팅에 발생. 여기, 메서드 포함 시체, refolding와 정화, Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3의 periplasmic dCACHE ligand 바인딩 도메인을 사용 하 여 예를 들어에서 단백질 복구를 위해 제공 됩니다. 접근 포함를 쪼갤와 관심사의 단백질의 표현을 그의6-태그, 격리 및 요소 중재 solubilisation 포함 시체, 친화성 크로마토그래피에 의하여 요소 고갈, 그리고 정화에 의해 refolding 단백질 태그 제거 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 따라. 원형이 색 성 분광학은 순수 단백질의 접힌된 상태를 확인 하는 데 사용 됩니다. 그것은이 프로토콜은 일반적으로 밀리 그램 양의 dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인의 가용성과 crystallisable 형태로 다른 세균성 chemoreceptors의 생산 하는 데 유용 증명 되었습니다.

그의6의 재조합 표현-Tlp3-포함 시체 증 착 단백질 귀착되 었 다 대장균 에 LBD. 세균성 문화 단계 2.13에서에서 계산의 1 l 식 수율은 약 100mg의 그의6-Tlp3-LBD 포함 시체에 있는 예금. 여기서 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 단백질 격리 절차 포함, 단백질을 refolding 몸과 정화 친화성 크로마토그래피, 태그 제거 및 크기 배제 크로마토?...

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Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

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