Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Vi takker Yu C. Liu for hans tidlige arbeide på Tlp3-LBD produksjon. Mayra A. Machuca er gjeld til Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS om doktor stipend.

1. uttrykk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli
<ol><li>Vaksinere 150 mL steril Luria-Bertani (LB) buljong som inneholder 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL celler forvandlet med pET151/D-TOPO vektoren for uttrykk for hans6- Tlp3-LBD (aminosyre rester 42-291), og Inkuber det på 37 ° C i en shaker (bane diameter, 25 mm) med 200 rpm over natten.</li>
	<li>Forberede seks 2 L Erlenmeyer flasker med 800 mL steril LB buljong og 50 µg mL-1 ampicillin. Vaksin...

En enkel prosedyre for uttrykk og refolding fra inkludering likene av den periplasmic LBD av bakteriell chemoreceptor Tlp3 presenteres. Utarbeidelse av ren protein innebærer over uttrykk for pET-plasmider-kodet genet E. coli, rensing og solubilisation av inkludering organer, refolding denaturert protein og rensing sin av påfølgende affinitet og størrelse-utestenging kromatografi trinn. Den urea-tilrettelagt rødsprit og fortynning/dialyse-mediert refolding er kritisk trinnene i protokollen, optimalisering so...

Chemotaxis og motilitet har vist å spille viktige roller i Campylobacter jejuni patogenesen ved å fremme bakteriell kolonisering og invasjonen av verten1,2,3. Chemotaxis kan bakterier til et optimalt miljø for vekst, som styres av kjemiske signaler. Denne prosessen innebærer anerkjennelse av intracellulær og miljømessige kjemiske signaler av et sett med proteiner kalt chemoreceptors eller svinger-lignende proteiner (Tlps). De fleste chemoreceptors er membran-embedded proteiner med en extracytoplasmic ligand bindende domene (LBD), en transmembrane domene og en cytoplasmatiske signalerer domenet, som samhandler med signal cytosolic proteiner som overfører signalet til flagellar motorer4,5,6,7.
Elleve forskjellige chemoreceptors har blitt identifisert i C. jejuni genomet4,8. Noen av disse chemoreceptors har vist hittil og ligand spesifisiteten av Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712og Tlp1113 er kjent. Identifikasjon av naturlige ligander de gjenværende chemoreceptors i denne arten og mange chemoreceptors i andre bakterier, kan være mye lettere ved produksjon av brettet og svært ren rekombinant chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. men forsøk på å heterologously express periplasmic LBDs av bakteriell chemoreceptors i Escherichia coli ofte føre målrettingen i inkludering organer17,18,19 . Likevel, dette fenomenet kan lette lett isolasjon og gjenoppretting av proteinet i hånden. Her vises en metode for protein utvinning fra inkludering organer, refolding og rensing, bruke den periplasmic LBD av C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som et eksempel. Dette eksemplet ble valgt fordi Tlp3-LBD tilhører dCACHE familie20 sensing domener som finnes rikelig i to-komponent histidin kinaser og chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.
I denne uttrykket konstruksjon, basert på en pET151/D-TOPO vektor, er utformet for å innlemme en N-terminal hans6-merket, etterfulgt av en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage nettsted, for etterfølgende kode fjerning19. Protokollen beskriver protein overuttrykte i E. coli, isolasjon og urea-mediert solubilisation av inkludering organer og protein refolding av urea uttømming. Etter refolding, prøven er renset ved affinitet Ture, med valgfri kode fjerning og størrelse-utestenging kromatografi. Foldet delstaten renset protein er bekreftet ved hjelp av sirkulære dichroism spektroskopi. Dette er en modifisert versjon av metoden som har blitt utviklet for å gjenopprette og rense LBD av en annen chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Denne prosedyren, oppsummert i figur 1gir 10-20 mg av ren, ukodede Tlp3-LBD per 1 L bakteriell kultur, med protein renhet av > 90% som anslagsvis SDS-side.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Identifikasjon av naturlige ligander chemoreceptors og strukturelle studier for utviklingen av molekylære grunnlaget for ligand spesifisitet kan være mye lettere ved produksjon av mg mengder rent, foldet ligand binding domener. Forsøk å uttrykke heterologously periplasmic ligand binding domener av bakteriell chemoreceptors i Escherichia coli (E. coli) ofte føre målrettingen i inkludering organer. Her vises en metode for protein utvinning fra inkludering organer, refolding og rensing, bruke periplasmic dCACHE ligand binding domenet Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som et eksempel. Tilnærmingen innebærer uttrykket av proteinet rundt med en cleavable hans6-tag, isolasjon og urea-mediert solubilisation av inkludering organer, protein refolding urea uttømming og rensing med affinitet Ture, etterfulgt av tag fjerning og størrelse-utestenging kromatografi. Sirkulære dichroism spektroskopi brukes til å bekrefte foldet tilstanden til ren protein. Det har blitt demonstrert at denne protokollen er vanligvis nyttig for produksjon av mg mengder dCACHE periplasmic ligand binding domener av andre bakterielle chemoreceptors i en løselig og crystallisable form.

Rekombinant uttrykk for hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterte i protein avsettelse i inkludering organer. Uttrykket avkastningen fra 1 L bakteriell kultur beregnet i trinn 2.13 var ca 100 mg av hans6-Tlp3-LBD avsatt i inkludering organer. Protein isolasjon prosedyren beskrevet her og illustrert i figur 1, består av solubilisation av inkludering organer, protein refolding og rensing, affinitet Ture, fjerning av merker og størrels...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

En prosedyre er presentert for refolding dCACHE periplasmic ligand binding domenet av Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 fra inkludering organer og rensing å gi mg mengder protein.

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metode for syntese av Peptoids med Mixed Lysin-type / Arginin-type Monomerer og evaluering av deres anti-leishmanial aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Effektiv rensing og LC-MS/MS-baserte analysen utvikling for ti-elleve translokasjon-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...