Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
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Agradecemos seus primeiros trabalhos sobre a produção de Tlp3-LBD-Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está em dívida com o Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS para uma bolsa de doutorado.

1. a expressão de seu6-Tlp3-LBD em e. coli
<ol><li>Inocular a 150 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) estéril contendo 50 µ g ampicilina de-1 de mL com BL21-códon-Plus (DE3) - células RIPL transformadas com o vetor de pET151/D-TOPO para expressão de seu6- Tlp3-LBD (resíduos de aminoácidos 42-291), e -incube a 37 ° C em um shaker (diâmetro da órbita, 25mm) com 200 rpm durante a noite.</li>
	<li>Prepare-se seis Erlenmeyers de 2L contendo 800 mL de caldo estéril de LB e ...

Um procedimento simples para a expressão e dobrar de corpos de inclusão do LBD periplasmático da chemoreceptor bacteriana Tlp3 é apresentado. Preparação da proteína pura envolve sobre-expressão do gene do animal de estimação-plasmídeo-codificado em e. coli, purificação e solubilização de corpos de inclusão, dobrar de proteína desnaturada e sua purificação por afinidade a consecutivos e etapas da cromatografia de exclusão de tamanho. A desnaturação de ureia-facilitado e diluição/diálise-m...

Quimiotaxia e a motilidade foram mostrados para desempenhar um papel importante na patogênese de Campylobacter jejuni , promovendo a colonização bacteriana e a invasão do hospedeiro1,2,3. Quimiotaxia permite que as bactérias para avançar para um ambiente ideal para o crescimento, como guiado por sinais químicos. Esse processo envolve o reconhecimento de sugestões químicas intracelulares e ambientais por um conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptor ou transdutor, como proteínas (TIPS). A maioria dos quimiorreceptores são proteínas de membrana-incorporado com um extracytoplasmic ligand binding domain (LBD), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático de sinalização, o último dos quais interage com as proteínas de sinalização citosólica que transmitem o sinal o flagelar motores4,5,6,,7.
Foram identificados onze quimiorreceptor diferentes do genoma de c. jejuni 4,8. Até à data, apenas alguns destes quimiorreceptores têm sido caracterizados e a especificidade de ligante de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 é conhecida. Identificação de ligantes naturais dos restantes quimiorreceptor nesta espécie e numerosos quimiorreceptor em outras bactérias, pode ser facilitada pela produção de dobrada e altamente puro recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. no entanto, as tentativas de heterologously express LBDs periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão17,18,19 . No entanto, este fenómeno pode facilitar fácil isolamento e recuperação da proteína na mão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o LBD periplasmático do c. jejuni chemoreceptor Tlp3 como exemplo. Este exemplo foi escolhido porque Tlp3-LBD pertence a família dCACHE20 de sensoriamento domínios que são encontrados abundantemente em dois-componente histidina quinases e quimiorreceptores em procariontes20,21, 22 , 23.
Nesta abordagem, a construção de expressão, com base em um vetor TOPO-pET151/D, foi projetada para incorporar um N-terminal dele6-etiqueta, seguido de um tabaco etch local de clivagem do protease do vírus (TEV), para marca subsequente remoção19. O protocolo descreve a superexpressão da proteína em e. coli, isolamento e solubilização de ureia-mediada de corpos de inclusão e proteína dobrar pela depleção de ureia. Após dobrar, a amostra é purificada por cromatografia de afinidade, com cromatografia de remoção e tamanho-exclusão opcional marca. O estado dobrado da proteína purificada é confirmado usando espectroscopia de Dicroísmo circular. Esta é uma versão modificada do método que foi desenvolvido anteriormente para recuperar e purificar o LBD de um chemoreceptor diferente, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimento, resumido na Figura 1, produz 10 a 20 mg de puro, sem marcas de formatação Tlp3-LBD por 1 L de cultura bacteriana, com uma pureza de proteína de > 90%, como estimado por SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Identificação de ligantes naturais de quimiorreceptores e estudos estruturais destinados a elucidação da base molecular da especificidade ligante pode ser facilitada pela produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação do ligante puro, dobrado. As tentativas de heterologously express domínios de ligação ligante periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli (e. coli) muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o domínio de ligação do ligante dCACHE periplasmático de Campylobacter jejuni (c. jejuni) chemoreceptor Tlp3 como exemplo. A abordagem envolve a expressão da proteína de interesse com um cleavable seu6-tag, isolamento e solubilização mediada por ureia, de corpos de inclusão, proteína dobrar pela depleção de ureia e purificação através de cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de tamanho-exclusão e remoção de marca. A espectroscopia de Dicroísmo circular é usada para confirmar o estado dobrado da proteína pura. Foi demonstrado que este protocolo é geralmente útil para produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação ligante periplasmático dCACHE de outros quimiorreceptor bacteriana na forma solúvel e crystallisable.

Expressão recombinante de seu6-Tlp3-LBD em e. coli resultou na deposição de proteína em corpos de inclusão. O expressão rendimento de 1 L de cultura bacteriana, calculada na etapa 2.13 foi aproximadamente 100 mg de seu6-Tlp3-LBD depositado em corpos de inclusão. O procedimento de isolamento de proteína, aqui descrito e ilustrado na Figura 1, consiste a solubilização de corpos de inclusão, proteína dobrar e purificaç...

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Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Bioquímica

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Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

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Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

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Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

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