Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Мы благодарим Yu C. Лю за его ранние работы на Tlp3-LBD производство. Майра A. Мачука долгу Departamento Admistrativo де науки, Tecnología e Innovación материалом для докторской стипендии.

1. выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli
<ol><li>Прививать 150 мл стерильного Бертани Лурия (LB) бульон, содержащий ампициллина-1 мл 50 мкг с BL21-Codon-плюс (DE3) - RIPL клеток превращается с pET151/D-TOPO вектор для выражения его6- Tlp3-LBD (аминокислотных остатков 42-291), и Проинкубируйте ее при 37 ° C в шейк...

Простая процедура для выражения и складывая от включения органов периплазматическое LBD бактериальных Хеморецепция Tlp3 представлен. Подготовка чистого белка подразумевает гиперэкспрессия кодировке ПЭТ плазмид ген в E. coli, очистки и solubilisation включения органов, складывая денатуриров...

Было показано, что хемотаксис и моторики играют важную роль в патогенезе Campylobacter jejuni , содействуя бактериальной колонизации и вторжения в узел1,2,3. Хемотаксис позволяет бактерии продвигаться к оптимальной среды для роста, как руководствоваться химические сигналы. Этот процесс предполагает признание внутриклеточные и экологических химические сигналы набор белков, называемых хеморецепторы, или датчика подобных белков (ПСТЛ). Большинство хеморецепторов являются белками мембраны встроенный с extracytoplasmic лигандом привязки домена (ОДД), трансмембранных доменов и цитоплазматических сигнализации домена, последний из которых взаимодействует с цитозольной сигнальных белков, которые передают сигнал flagellar моторы4,5,6,7.
Одиннадцать различных хеморецепторов были определены в геном C. jejuni ,4,,8. На сегодняшний день, только некоторые из этих хеморецепторов характеризовали и специфика лигандом Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712и Tlp1113 известен. Идентификация природных лигандов оставшиеся хеморецепторов в этой породы, и многочисленные хеморецепторов в других бактерий, может быть существенно облегчено производство рекомбинантных Хеморецепция складывается и высоки чисто LBDs14, 15 , 16. Однако попытки участием Экспресс периплазматическое LBDs бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli часто приводить их ориентации на включение органов17,18,19 . Тем не менее это явление может облегчить легко изоляции и восстановления белка в руке. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя периплазматическое LBD C. jejuni Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот пример был выбран потому, что Tlp3-LBD принадлежит dCACHE семьи20 зондирования доменов, которые обильно нашли в двухкомпонентных гистидина киназы и хеморецепторов в прокариотах20,21, 22 , 23.
В этом подходе, конструкции выражения, основанные на pET151/D-TOPO вектор, был разработан для включения N-терминальный его6-тега, после чего табак etch вирус (TEV) протеазы расщепления сайта, для последующего тег удаления19. Протокол описывает гиперэкспрессия белка в E. coli, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, и белок, складывая мочевины истощения. После складывая, образец очищается хромотографией сродства с необязательный тег удаления и размер исключения хроматографии. Сложенном состоянии очищенный протеин подтверждается с помощью круговой дихроизма спектроскопии. Это измененная версия метода, который был ранее разработан чтобы восстановить и очистить LBD различных Хеморецепция, Helicobacter pylori TlpC19. Эта процедура, резюмируется в Рисунок 1, дает 10-20 мг чистого, без тегов Tlp3-LBD на 1 Л бактериальной культуры, с чистотой белка > 90% по оценкам SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Идентификация природных лигандов хеморецепторы и структурных исследований, направленных на выяснение молекулярные основы лигандом специфики может быть значительно облегчено производства количествах миллиграмм чистой, сложить лигандом связывания доменов. Попытки участием Экспресс периплазматическое лигандом связывания доменов бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli (E. coli) часто привести их ориентации в включение тела. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя домен привязки лигандом периплазматическое dCACHE Campylobacter jejuni (C. jejuni) Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот подход включает в себя выражение протеина интереса с горные его6-тег, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, белка, складывая мочевины истощения, и очистки с помощью аффинной хроматографии, Затем тег удаления и размер исключения хроматографии. Спектроскопия круговой дихроизма используется для подтверждения сложенном состоянии чистого белка. Было продемонстрировано, что этот протокол является обычно полезно для производства количествах миллиграмм dCACHE периплазматическое лигандом связывания доменов других бактериальная хеморецепторов в виде растворимых и кристаллизирующихся.

Рекомбинатные выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli в результате осаждения белков в включения органов. Выражение доходность от 1 Л бактериальной культуры, рассчитанные на шаге 2.13 был приблизительно 100 мг его6-Tlp3-LBD, депонируется в включения органов. Процедура изоля...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Процедура представлен складывая dCACHE периплазматическое лигандом привязки области Campylobacter jejuni Хеморецепция Tlp3 от включения органов и очистки приносить миллиграмм количества белка.

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Эффективный метод синтеза Пептоиды с мономерами смешанного типа Лизин / аргинин-типа и оценки их Анти-leishmanial деятельности

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Эффективное очищение и LC-MS/MS-на основе анализа развития для десяти-одиннадцати транслокации-2 5-метилцитозин Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...