Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
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Damos las gracias por sus primeros trabajos en la producción de LBD Tlp3 Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está en deuda con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS Beca doctoral.

1. expresión de su6-Tlp3-LBD en e. coli
<ol><li>Sembrar 150 mL de caldo Luria-Bertani (LB) estéril que contenga 50 ampicilina de μg mL-1 con el Plus de codón BL21 (DE3) - células RIPL transformadas con el vector de pET151/D-TOPO para la expresión de su6- Tlp3-LBD (residuos del aminoácido 42-291), y incubarlo a 37 ° C en un agitador (diámetro de la órbita, 25 mm) con 200 rpm durante la noche.</li>
	<li>Preparar seis matraces de Erlenmeyer de 2 L que contenga 800 mL de ...

Se presenta un procedimiento sencillo para la expresión y refolding de cuerpos de inclusión de la LBD periplasmic del quimioreceptor bacteriana Tlp3. Preparación de la proteína pura implica la sobre expresión del gen pET plasmídico de e. coli, la purificación y la solubilización de los cuerpos de inclusión, refolding de la proteína desnaturalizada y su purificación por afinidad consecutiva y pasos de cromatografía por exclusión de tamaño. La desnaturalización facilitado por urea y dilución/diáli...

Quimiotaxis y motilidad han demostrado que desempeñan papeles importantes en la patogénesis del jejuni del Campylobacter promoviendo la colonización bacteriana y la invasión de los host1,2,3. Quimiotaxis permite que las bacterias lograr un ambiente óptimo para el crecimiento, como guiados por señales químicas. Este proceso implica el reconocimiento de señales químicas intracelulares y ambientales por un conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptores o transductor-como proteínas (Tlps). La mayoría quimioreceptores son proteínas embebido en la membrana con un extracytoplasmic ligando vinculante dominio (LBD), un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de señalización, que interactúa con las proteínas de señalización citosólicas que transmiten la señal los motores flagelares4,5,6,7.
Once quimioreceptores diferentes se han identificado en el genoma de C. jejuni 4,8. Hasta la fecha, sólo algunos de estos quimioreceptores han sido caracterizados y se sabe la especificidad del ligando de Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712y Tlp1113 . Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores restantes en esta especie y numerosos Quimioreceptores en otras bacterias, puede facilitarse grandemente por la producción de plegado y altamente puro recombinante quimioreceptor LBDs14, 15 , 16. sin embargo, los intentos de expresar heterologously periplasmic LBDs de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión17,18,19 . Sin embargo, este fenómeno puede facilitar la fácil aislamiento y recuperación de la proteína en la mano. Aquí, se presenta un método para recuperación de proteína de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, con el LBD periplasmic de la C. jejuni quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. Este ejemplo fue elegido porque Tlp3-LBD pertenece a la familia de dCACHE20 de dominios de detección que se encuentran abundantemente en dos componentes histidina quinasas y quimiorreceptores en procariotas20,21, 22 , 23.
En este enfoque, la construcción de la expresión, basada en un vector de pET151/D-TOPO, ha sido diseñada para incorporar un N-terminal su6-etiqueta seguida de un tabaco etch virus (TEV) proteasa escote sitio para etiqueta posterior retiro19. El protocolo describe la sobreexpresión de la proteína en e. coli, el aislamiento y la urea mediada la solubilización de los cuerpos de inclusión y la proteína refolding por agotamiento de la urea. Después refolding, la muestra se purifica mediante cromatografía de afinidad, con cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta opcional. El estado plegado de la proteína purificada se confirma mediante espectroscopía de dicroísmo circular. Esta es una versión modificada del método que se ha desarrollado anteriormente para recuperar y purificar el LBD de un quimioreceptor diferentes, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimiento, resumido en la figura 1, rinde 10 a 20 mg de puro, sin etiquetar Tlp3-LBD por 1 L de cultivo bacteriano, con una pureza de la proteína de > 90% estimados por SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores y estudios estructurales dirigidos a la aclaración de las bases moleculares de la especificidad del ligando puede facilitarse grandemente por la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando pura, doblado. Intentos de expresar heterologously dominios de unión a ligando periplasmic de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli (e. coli) a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión. Aquí, se presenta un método para la recuperación de proteínas de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, mediante el dominio de enlace de ligando dCACHE periplasmic de Campylobacter jejuni (C. jejuni) quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. El enfoque implica la expresión de la proteína de interés con un escindibles sus6-etiqueta, aislamiento y solubilización de urea-mediada de cuerpos de inclusión, refolding por agotamiento de la urea y purificación mediante cromatografía de afinidad, la proteína seguido por cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta. La espectroscopía de dicroísmo circular se utiliza para confirmar el estado plegado de la proteína pura. Se ha demostrado que este protocolo es generalmente útil para la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando periplasmic dCACHE de otros quimiorreceptores bacterianas en forma soluble y cristalizables.

Expresión recombinante de su6-Tlp3-LBD en e. coli dio lugar a la deposición de la proteína en los cuerpos de inclusión. El rendimiento de la expresión de 1 L de cultivo bacteriano calculado en el paso 2.13 fue de aproximadamente 100 mg de su6-Tlp3-LBD depositado en cuerpos de inclusión. El procedimiento de aislamiento de proteínas, aquí descrito e ilustrado en la figura 1, consiste en la solubilización de los cuerpos de...

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Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Investigación

Bioquímica

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

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Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...