Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Vi tackar Yu C. Liu för hans tidiga verk på Tlp3-LBD produktion. Mayra A. Machuca är skuldsatta att Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnologia e Innovación COLCIENCIAS doktorand stipendium.

1. redovisning av hans6-Tlp3-LBD i E. coli
<ol><li>Inokulera 150 mL steril Luria-Bertani (LB) buljong som innehåller 50 µg mL-1 ampicillin med BL21-kodon-Plus (DE3) - RIPL celler omvandlas med den pET151/D-TOPO vektorn uttryck för hans6- Tlp3-LBD (aminosyra rester 42-291), och Inkubera det vid 37 ° C i en shaker (bana diameter, 25 mm) med 200 rpm över natten.</li>
	<li>Förbereda sex 2 L Erlenmeyer-kolvar som innehåller 800 mL steril LB buljong och 50 µg mL-1 ...

En enkel procedur för uttryck och vika från inkludering organ av den periplasmic LBD av den bakteriella chemoreceptor Tlp3 presenteras. Förberedelse av ren protein innebär över uttrycket av genen pET-plasmid-kodad i E. coli, rening och vävnadsupplösning inkludering organ, vika av denaturerat protein och rening av på varandra följande affinitet och storlek-utslagning kromatografi steg. De urea-stödda denaturering och utspädning/dialys-medierad vika är de kritiska steg i protokollet, optimering av som ...

Kemotaxis och motilitet har visat att spela viktiga roller i Campylobacter jejuni patogenes genom att främja bakteriell kolonisering och invasion av värd1,2,3. Chemotaxis tillåter bakterierna att närma sig en optimal miljö för tillväxt, som styrs av kemiska signaler. Denna process innebär erkännande av intracellulära och miljömässiga kemiska signaler genom en uppsättning av proteiner som kallas kemoreceptorer, eller givare-liknande proteiner (Tlps). De flesta kemoreceptorer är membran-inbäddade proteiner med en extracytoplasmic ligand bindande domän (LBD), en transmembrana domän och en cytoplasmiska signalering domän, den senare som interagerar med de cytosoliska signalering proteiner som sänder signalen till flagellar motorer4,5,6,7.
Elva olika kemoreceptorer har identifierats i C. jejuni genomet4,8. Hittills har endast några av dessa kemoreceptorer präglats och ligand specificitet Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712och Tlp1113 är känd. Identifiering av naturliga ligander de återstående kemoreceptorer i denna art, och talrika kemoreceptorer i andra bakterier, kan underlättas avsevärt genom produktion av vikta och högt rena rekombinant chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. men försök att heterologously express periplasmic LBDs av bakteriell kemoreceptorer i Escherichia coli ofta resultera i deras inriktning till inkludering organ17,18,19 . Dock kan detta fenomen underlätta lätt isolering och återvinning av protein i hand. Här presenteras en metod för protein återhämtning från organ i inkludering, vika och rening, med den periplasmic LBD av C. jejuni chemoreceptor Tlp3 som exempel. Detta exempel valdes eftersom Tlp3-LBD tillhör den dCACHE familjära20 fjärranalys domäner som finns rikligt i tvåkomponents histidin kinaser och chemoreceptors i prokaryoter20,21, 22 , 23.
I denna strategi, den uttryck bygga, baserat på en pET151/D-TOPO vektor, har utformats för att införliva en N-terminal hans6-etiketten följt av en tobak etch virus (TEV) proteas klyvning webbplats, för efterföljande tagg borttagning19. Protokollet beskrivs protein överuttryck i E. coli, isolering och urea-medierad vävnadsupplösning av inkludering kroppar och protein vika av urea utarmning. Efter vika, provet renas genom affinitetskromatografi, med valfri tagg borttagning och storlek-utslagning kromatografi. Vikta staten av renat protein bekräftas med cirkulärdichroism spektroskopi. Detta är en modifierad version av den metod som tidigare har utvecklats för att återställa och rena LBD av en olika chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Detta förfarande, sammanfattas i figur 1, räntor 10-20 mg ren, otaggade Tlp3-LBD per 1 L av bakterieodling, med en renhet som proteinet > 90% som uppskattade av SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Identifiering av naturliga ligander kemoreceptorer och strukturella studier syftar till att klarlägga den molekylära basen för ligand specificitet kan underlättas avsevärt av produktionen av milligram mängder ren, vikta ligand bindande domäner. Försök att heterologously express periplasmic ligand bindande domäner av bakteriell kemoreceptorer i Escherichia coli (E. coli) ofta leder till sin inriktning i inkludering kroppar. Här presenteras en metod för protein återhämtning från inkludering organ, dess vika och rening, med periplasmic dCACHE ligand bindande domän Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 som exempel. Metoden innebär uttryck av proteinet av intresse med en cleavable hans6-tagg, isolering och urea-medierad vävnadsupplösning inkludering organ, protein vika av urea utarmning och rening genom affinitetskromatografi, följt av taggen borttagning och storlek-utslagning kromatografi. Den cirkulärdichroism spektroskopin används för att bekräfta den vikta delstaten det rent proteinet. Det har visats att detta protokoll är allmänt användbara för produktion av milligram belopp av dCACHE periplasmic ligand bindande domänerna i andra bakteriella kemoreceptorer i lösliga och kristalliserbart form.

Rekombinant uttryck för hans6-Tlp3-LBD i E. coli resulterade i protein avlagring i inkludering organ. Uttryck avkastningen från 1 L av bakterieodling som beräknades i steg 2.13 var cirka 100 mg av hans6-Tlp3-LBD deponeras i inkludering organ. Förfarandet protein-isolering, beskrivs här och illustreras i figur 1, består av vävnadsupplösning för inkludering organ, protein vika och rening, genom affinitetskromatografi, tag...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

En procedur presenteras för att vika av dCACHE periplasmic ligand bindande domän Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 från organ i inkludering och rening till avkastning milligram mängder protein.

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metod för syntes av Peptoider med blandad lysin-typ / Arginin-monomerer och utvärdering av deras anti-leishmanial aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metod för att bestämma konstanten Dissociation av Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Effektiv rening och LC-MS/MS-baserad analys utveckling för tio-elva translokation-2 5-metylcytosin dioxygenas

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...