Name: method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Yu C. Liu Tlp3-yakın üretim üzerine erken çalışmaları için teşekkür ediyoruz. Mayra A. Machuca Paraguay Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS doktora burs için borçlu.

1. ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın
<ol><li>150 mL steril Luria-Bertani (LB) suyu 50 µg mL-1 Ampisilin ile BL21-kodon-Plus (DE3) içeren aşılamak - RIPL hücreleri ile ifade onun6pET151/D-TOPO vektör dönüşüm - Tlp3-yakın (amino asit kalıntıları 42-291), ve Bu bir shaker (yörünge çapı, 25 mm) 37 ° C'de 200 d / gecede kuluçkaya.</li>
	<li>800 mL steril LB suyu ve 50 µg mL-1 Ampisilin içeren altı 2 L Erlenmeyer şişe hazırlayın. Her şişesi 20 m...

İfade ve bakteriyel chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın dahil vücutlarından refolding için basit bir yordam sunulur. Saf protein hazırlanması içerir E. coli, arıtma ve solubilisation dahil organlarının evde beslenen hayvan-plazmid kodlu genin aşırı ifade denatüre protein ve onun arıtma ardışık benzeşimi tarafından refolding ve Boyut-dışlama Kromatografi adımları. Denatürasyon üre kolaylaştırdı ve seyreltme/diyaliz-aracılı refolding protokolündeki optimizasyonu hangi kez dahil or...

Kemotaksis ve motilite bakteri kolonizasyonu ve ana bilgisayar1,2,3işgali teşvik ederek Campylobacter jejuni patogenezinde önemli rol oynamaya gösterilmiştir. Kemotaksis kimyasal sinyalleri tarafından güdümlü olarak bakteri büyüme için en iyi bir ortam doğru taşımak izin verir. Bu işlem chemoreceptors olarak adlandırdığı proteinler veya dönüştürücü gibi proteinler (TIPS) kümesi tarafından tanınması hücre içi ve çevresel kimyasal ipuçları içerir. Çoğu chemoreceptors proteinler membran katıştırılmış bağlayıcı etki alanı (yakın), bir transmembran ve ikincisi olan sinyal iletimi sitozolik sinyalizasyon proteinler ile etkileşim bir sitoplazmik sinyal verme etki alanı, bir extracytoplasmic ligand ile vardır kamçılı motorlar4,5,6,7.
Onbir farklı chemoreceptors C. jejuni genom4,8' tespit edilmiştir. Bugüne kadar bu chemoreceptors yalnızca bazılarını tanımlanabilecek ve Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712ve13 Tlp11 ligand özgüllük bilinmektedir. Bu türler içinde kalan chemoreceptors ve çok sayıda chemoreceptors diğer bakterilerde doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde katlanmış ve son derece saf rekombinant chemoreceptor LBDs14, üretim tarafından kolaylaştırılabilir 15 , 16. ancak, girişimleri heterologously Escherichia coli bakteri chemoreceptors periplasmic LBDs sık sık ifade etmek için neden kendi dahil organları17,18,19 hedefleme . Yine de, bu olay kolay yalıtım ve kurtarma protein el kolaylaştırabilir. Burada, protein kurtarma dahil organları, refolding ve arıtma, C. jejuni chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın bir örnek olarak kullanarak bir yöntem sunulur. Çünkü, iki bileşenli histidin kinaz ve prokaryotlar20,21, chemoreceptors bol bol bulunan algılama etki alanlarının dCACHE aile20 Tlp3-yakın ait bu örnek seçildi 22 , 23.
Bu yaklaşım, pET151/D-TOPO vektör üzerinde alarak ifade inşa bir N-terminal onun6dahil etmek için dizayn edilmiştir-etiket bir tütün tarafından takip etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi, sonraki etiketi kaldırma19. E. coli, yalıtım ve dahil organları ve üre tükenmesi tarafından refolding protein solubilisation üre-aracılı protein overexpression protokolünü açıklar. Refolding, aşağıdaki örnekte benzeşimi Kromatografi, isteğe bağlı etiket kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile tarafından saf. Saf protein katlanmış durumunu dairesel dichroism spektroskopisi kullanılarak doğrulanır. Bu daha önce yeniden elde etmek ve farklı bir chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19yakın arındırmak için geliştirilen yöntem değiştirilmiş bir sürümü var. Şekil 1' de özetlenmiştir bu yordamı, saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü, 1 litre başına 10-20 mg protein saflığı verimleri > SDS-sayfa tarafından tahmini olarak % 90'ı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MERK MILLIPORE</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>G-BIOSCIENCES</td>
			<td>A051-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>52332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>AST0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>C-1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine monohydrochloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxidized L-glutathione</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>&#160;7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC20302.260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td>
			<td>BIOGB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride (NiCl2)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>VWRC0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)</td>
			<td>NEW ENGLAND BIOLABS</td>
			<td>P7703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td>
			<td>Dialysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snakeskin dialysis tubing</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC&#8482;</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepacked HiTrap Chelating HP column</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>17-0408-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser</td>
			<td>AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex&#8482; - C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump P-1</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>18-1110-91&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column&#160;</td>
			<td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td>
			<td>28989336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>J-815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for efficient refolding and purification of chemoreceptor ligand binding domain

Chemoreceptors ve yapısal çalışmaların ligand özgüllük moleküler temeli aydınlatma amaçlı doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde saf, katlanmış ligand bağlayıcı etki alanları miligram miktarda üretim tarafından kolaylaştırılabilir. Heterologously periplasmic ligand bağlayıcı etki bakteriyel chemoreceptors Escherichia coli (e.coli) sık sık ifade etmek için girişimleri kendi dahil bedenlere hedefleme neden. Burada, bir yöntem dahil organları, onun refolding ve arıtma periplasmic dCACHE ligand bağlayıcı etki Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3, örnek olarak kullanarak, protein kurtarma için sunulmaktadır. Yaklaşım ifade ilgi ile bir yarilabilir protein içerir onun6-etiketi, yalıtım ve dahil organlarının solubilisation üre-aracılı protein üre tükenmesi ve arıtma benzeşme Kromatografi ile refolding etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından takip. Dairesel dichroism spektroskopisi saf protein katlanmış durumunu doğrulamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı genellikle dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki alanından diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable miligram miktarda üretim için yararlıdır kanıtlanmıştır.

Rekombinant ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın protein ifade dahil organlarında sonuçlandı. Onun6yaklaşık 100 mg 1 l bakteri kültürü 2,13 adımda hesaplanan ifade verim yapıldı-Tlp3-yakın dahil gövdelerinde yatırılır. Burada açıklanan ve şekil 1' de, resimli protein yalıtım, solubilisation dahil organları, protein refolding ve arıtma, benzeşim Kromatografi, etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain at JoVE.com

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...