Name: isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00
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I borse di studio supportato da NIH AI102838 e AI117739 (CRW). Si ringrazia Richard Rossoll per assistenza tecnica. L'analisi cytometric di flusso è stato effettuato in DartLab, la risorsa condivisa alle Dartmouthsupported di (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

Secondo i principi espressi nella dichiarazione di Helsinki sono stati condotti studi che coinvolgono soggetti umani. Gli studi sono stati approvati da Dartmouth College Institutional Review Board e il Comitato per la protezione di soggetti umani (CPHS). Consenso informato è stato ottenuto prima dell'intervento chirurgico da HIV-negativi donne sottoposte a isterectomia a Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). I patologi addestrati selezionati campioni di tessuto dal EM, CX ed ECX, privo di lesioni anatomo-pat...

<ol>
	<li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract.">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells:+Two+complementary+and+integrated+functional+systems.">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li><li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface.">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li><li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium:+potential+targets+for+HIV+infection.">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).</li><li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle.">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li><li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells.">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li><li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1.">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li><li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses.">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract:+comparison+of+fallopian+tube,+uterus,+cervix,+and+vagina.">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV.">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4++Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract.">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li><li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues.">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li></ol>

DCs mucoso sono una popolazione di cellule rare fortemente influenzata dall'ambiente del tessuto, che cambia il loro fenotipo e la funzione una volta entrati i tessuti3. Mentre il sangue derivate DCs sono un modello molto utile, non rappresentano pienamente la diversità delle popolazioni DC trovati nei tessuti. Pertanto, per capire le caratteristiche uniche del DCs mucoso, isolamento di cellule primarie da tessuti è necessario. Isolamento di DCs da diverse sedi anatomiche nella FRT offre l'oppor...

La FRT ha la duplice funzione di protezione contro gli agenti patogeni consentendo l'impianto e la gravidanza1. A tale scopo, è suddiviso in compartimenti la FRT, con ogni regione anatomica visualizzati uniche caratteristiche istologiche, immunologiche e funzionale1.
Controller di dominio presenti alle superfici mucose prendere contatto con i microbi nel polmone, intestino e del tratto genitale e fornire sorveglianza immune per potenziali agenti patogeni2. Controller di dominio hanno la capacità unica di adescare ingenuo T-cellule e innescare risposte immunitarie3. Controller di dominio nella FRT sono specializzati anche per tollerare antigeni estranei, come quelli trovati in sperma e lo sviluppo del feto, per consentire la riuscita gravidanza4. Pertanto, a seconda della posizione, la DC fenotipo e la funzione sarà distinti. È noto che DCs sono fortemente influenzati dall'ambiente di tessuto, tale che il loro numero, il fenotipo e la funzionalità vengono modificate dall'ambiente del tessuto in cui risiedono3. Pertanto, per comprendere il ruolo nelle malattie infettive, gravidanza e cancro nella FRT FRT DCs, DCs residenti devono essere studiati, dal sangue e modelli derivati DC sono insufficienti ad affrontare le complessità normative trovate nei tessuti FRT.
La caratterizzazione di tessuti umani residenti DCs è impegnativo a causa del basso numero di cellule presenti nei tessuti mucosi e la difficoltà di ottenere campioni di tessuto umano. Controller di dominio sono stati studiati in FRT usando immunohistochemistry5,6, che informa circa la posizione di cella all'interno del tessuto, ma esclude gli studi funzionali e viene limitato il numero di identificazione di marcatori di cellule che possono essere analizzati in una sola volta. Inoltre, i protocolli di isolamento di singola cellula per l'analisi cytometric di flusso sono stati sviluppati7,8,9. Alcuni di questi protocolli approfitta della capacità migratoria del DCs per isolare quelle cellule che migrano. Questi metodi solitamente richiedono incubazioni overnight e selezione di DC attivate, ma non consentono per lo studio dei controller di dominio nello stato di stabilità.
Qui, utilizzando esemplari di isterectomia, abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare DCs da diverse sedi anatomiche in FRT, l'endometrio (EM), l'endocervice (CX) e l'esocervice (ECX), che consente analisi sia fenotipiche e funzionali. Utilizza un protocollo non proteolitico digestione enzimatica, possiamo procedere immediatamente dopo la digestione del tessuto alla caratterizzazione di cella isolamento e flusso cytometric senza l'attivazione delle cellule. Mediante citometria a flusso multicolor e adattando gli studi funzionali per un basso numero di cellule, possiamo identificare e caratterizzare rare sottoinsiemi di controller di dominio in diversi siti della FRT

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:203px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30015.03</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 um Stericup 500 mL&#160; filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 25mm polystyrene dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>Treated cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Isotemp Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FICO3500TABB</td>
			<td>5.0% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">American Rotator V</td>
			<td>American DADE</td>
			<td>R4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-250/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-20/14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman GS-6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>358702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>CL-253</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dead Cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-separation filter (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadro MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi-stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD1a Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-051-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eFluor 670 cell proliferation dye</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>9/8/2866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie yellow viability dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 APC/Cy7, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>25-0038-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4 PE, anti-human</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0048-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a FITC, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0086-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B43618</td>
			<td>10 color, VBR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSquant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-343</td>
			<td>8 color, VBR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

La caratterizzazione di umane cellule dendritiche (DCs) residente in tessuti mucosi è impegnativa a causa della difficoltà nell'ottenere i campioni, e i numeri bassi dei controller di dominio presentano al tessuto. Eppure, come il fenotipo e la funzione di controller di dominio viene modificato dall'ambiente del tessuto, è necessario analizzare le popolazioni residenti di DC del tessuto, poiché sangue derivati DCs in modo incompleto riflettere la complessità del DCs nei tessuti. Qui presentiamo un protocollo per isolare DCs da umano tratto riproduttivo femminile (FRT) utilizzando esemplari di isterectomia che permette analisi sia fenotipiche e funzionali. Il protocollo è costituito da digestione del tessuto per generare una singola cellula miscelati sospensione cellulare, seguita da una selezione positiva biglie magnetiche. Il nostro protocollo di digestione del tessuto non fendere gli indicatori di superficie, che permette l'analisi fenotipica e funzionale di DCs in regime stazionario, senza attivazione di incubazione o cella durante la notte. Questo protocollo può essere adattato per l'isolamento di altri tipi di cellule immunitarie o di DCs da altri tessuti.

Seguente digestione del tessuto, il rilascio di strati epiteliali e ghiandole può essere osservata, come mostrato in Figura 1A; si tratta di un controllo positivo che indica che la digestione enzimatica è stata completata. Il numero di cellule vitali totale e DCs recuperato per grammo di tessuto è anche mostrato in Figura 1B e Figura 1, rispettivamente. Cellule del sistema immunitario rappresentan...

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

Descriviamo qui un metodo per isolare e purificare le cellule dendritiche da diversi compartimenti anatomici nel tratto riproduttivo femminile umano per la valutazione delle loro caratteristiche fenotipiche e funzionali. Questo metodo può essere adattato per isolare altre cellule immuni o cellule dendritiche da altri tessuti mucosi.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

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