Name: isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00
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NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.

인체와 관련 된 연구는 헬싱키의 선언에 표현 하는 원칙에 따라 실시 했다. 연구는 다트머스 대학 기관 검토 위원회와 보호의 인간의 과목 (CPHS)를 위한 위원회에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 다트머스-히치콕 병원 (레바논, NH) hysterectomies를 받고 HIV 음성 여성에서 수술 전에 얻은 했다. 숙련 된 병리학 ECX, 병 적인 장애의 자유롭고 병 리의 사이트에서, CX, 및 그들에서 조직 샘플을 선택. 혈액 샘?...

<ol>
	<li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract.">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells:+Two+complementary+and+integrated+functional+systems.">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li><li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface.">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li><li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium:+potential+targets+for+HIV+infection.">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).</li><li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle.">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li><li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells.">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li><li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1.">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li><li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses.">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract:+comparison+of+fallopian+tube,+uterus,+cervix,+and+vagina.">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV.">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4++Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract.">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li><li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues.">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li></ol>

점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하...

FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:203px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30015.03</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 um Stericup 500 mL&#160; filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 25mm polystyrene dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>Treated cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Isotemp Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FICO3500TABB</td>
			<td>5.0% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">American Rotator V</td>
			<td>American DADE</td>
			<td>R4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-250/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-20/14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman GS-6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>358702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>CL-253</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dead Cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-separation filter (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadro MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi-stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD1a Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-051-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eFluor 670 cell proliferation dye</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>9/8/2866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie yellow viability dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 APC/Cy7, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>25-0038-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4 PE, anti-human</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0048-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a FITC, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0086-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B43618</td>
			<td>10 color, VBR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSquant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-343</td>
			<td>8 color, VBR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.

다음 조직 소화, 상피 시트와 땀 샘의 릴리스 관찰 될 수 있다, 그림 1A;와 같이 이것은 효소 소화 성공적인 나타내는 긍정적인 컨트롤입니다. 총 실행 가능한 세포 및 조직의 그램 당 복구 Dc의 숫자도 표시 됩니다 그림 1B 및 그림 1C, 각각. 면역 세포 밀도 원심12,13</sup...

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...