Name: dissecting multi-protein signaling complexes by bimolecular complementation affinity purification (bicap)
Uploaded: 2018-06-15T13:30:00
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D.R.C ist Krebs Institut NSW Fellow und D.N.S war zuvor Mitglied Cancer Institute New South Wales. Die Forschungsergebnisse präsentiert in dieser Handschrift wurden von Cancer Institute New South Wales (13/FRL/1-02 und 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), New South Wales Office of Science und medizinische Forschung, Gastfamilie finanziert. Gemeinschaft und Mostyn Family Foundation. Empfänger eines australischen Postgraduate Awards waren J.F.H. und R.S.

(1) Plasmid Klonen
Hinweis: Um Plasmid-Vektoren mit den V1 oder V2 Tags verschmolzen, der N-Terminus oder C-Terminus des Gens von Interesse zu erzeugen, BiFC Ziel Vektoren hinterlegt worden mit Addgene [N-Terminal-Tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminale Tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Gen/s von Interesse müssen in bestimmten Rekombination Klonen kompatibel Eintrag Vektoren (z.B. pDONR223 oder pENTR221), ohne Stop-Codons, zum Klonen fortsetzen ...

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BiCAP ist eine leistungsfähige Methode zur Isolierung von spezifischen Proteins Dimere beim Ausschließen der einzelnen Komponenten und ihre konkurrierende verbindliche Partner3. BiCAP basiert auf Anpassung eines Fluoreszenz Protein-Ergänzung Assays BiFC6genannt. Bestehende Methoden, einschließlich BiFC und Nähe Ligatur-Assays, zu visualisieren und zu quantifizieren, Protein-Interaktionen in lebenden Zellen7ausgiebig, aber kein wirksames Mittel z...

Protein-komplexen Baugruppe ist ein Schlüsselprozess bei der Aufrechterhaltung der raumzeitlichen Spezifität von vielen Signalisierung Wege1,2. Während die kritische Natur dieser regulatorische Rolle allgemein anerkannt ist, gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken zur Verfügung, um diese komplexe unter die Lupe nehmen. Die meisten phänotypische Studien konzentrieren sich auf Interaktionen mit einzelne Proteine oder die sequentielle Bereicherung einzelner komplexe Komponenten. Hier präsentieren wir eine Technik für die Isolierung von einem spezifischen Protein-Dimer, während mit Ausnahme der einzelnen Moieties Komponente Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden verbindliche Partner3gebildet. Wir haben diese Technik namens Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP), es ist eine Kombination eines bereits vorhandenen Protein Fragment Komplementierung Assays, Bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC), mit dem neuartigen Einsatz von einer Konformation-spezifische rekombinante gemeinnützige GFP und seine Derivate (siehe Table of Materials).
Ein typische Protein-Fragment Komplementierung Assay stützt sich auf den Ausdruck der "Köder" und "Beute" Proteine verschmolzen um Fragmente der Reporter wie Luciferase4, β-Galaktosidase5oder grün fluoreszierendes Protein (GFP)6 ( teilen Abbildung 1A). Durch das Zusammenspiel der Köder und Beute Proteine sollen die Split-Reporter-Domänen in eine funktionale Struktur, so dass die Interaktion des Köders Umfalten und Beute Proteine visualisiert oder quantifiziert werden. BiCAP wurde von einer Version dieser Technik, die aus der Fragmente der GFP Variante Venus verwenden. Fluoreszierendes Protein-Ergänzung-Assays sind eine beliebte Methode zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in einer live-Zelle, aber bis jetzt wurden auf diese eine Funktion7beschränkt. BiCAP stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Hinsicht, da diese Technik nicht nur zur Visualisierung, aber auch die Isolation und Verhöre der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktion erlaubt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig1.jpg"> Abbildung 1: die strukturelle wichtigsten hinter die BiCAP Technik. (A) ein Schema skizziert die wichtigsten hinter Bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung zeigt "bait" und "Beute" Proteine mit der N-terminalen V1 oder V2 C-terminale Fragmente des Full-Length Venus Proteins markiert. (B) strukturelle Analyse der Interaktion (Cyan) Schnittstelle zwischen der GFP gemeinnützige (grün) und rekombinierte Venus, welche die Position der (grau) V1 und V2 (orange) Fragmente (PDB Beitritt 3OGO). Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
BiCAP macht Technik verwenden zwei nicht fluoreszierenden Fragmente der Venus (benannt V1 und V2), die mit einem niedrigen Grad von Affinität zu verbinden, es sei denn, eine Interaktion zwischen ihrer Fusion Partner auftritt. In diesem Fall Einspritzen die beiden geteilten Domains in die funktionale β-Fass-Struktur der Fluorophor (Abbildung 1 b)6. Die entscheidende Neuerung des BiCAP stammt aus der Einführung des rekombinanten GFP-gemeinnützige, die eine dreidimensionale Epitop auf dem β-Fass GFP (und Varianten wie Venus) erkennt, die nur auf die korrekt rekombinierte und gefalteten Fluorophor ( vorhanden ist Abbildung 1 b)8. Entscheidend ist, bindet die GFP gemeinnützige nicht entweder die einzelnen Fragmente der Venus. Dies erleichtert die Isolierung von Proteinen Dimere erst, nachdem die beiden Proteine, einen Komplex aus eigenem Antrieb gebildet haben, führt zu mehr repräsentative Ergebnisse als die erworbenen aus Methoden, die machen von chemisch induzierten, erzwungene Interaktionen9verwenden.
BiCAP ist eine leistungsstarke Technik, die speziell auf Multi-Protein-komplexe, die potenziell können, mit einer Anzahl von downstream-Anwendungen kombiniert werden, die Granularität der unser Verständnis von der Rolle zu verbessern, die diese komplexe in der Signaltransduktion spielen . Es umfasst auch das wichtige Merkmal der Visualisierung von Protein-Interaktionen in Situermöglicht. Bis heute BiCAP als eine wirksame Methode zur Analyse der Interaktom von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Dimere3nachgewiesen, aber die Anpassungsfähigkeit dieser Methode bedeutet, dass es in fast jedem Protein Interaktion Kontext angenommen werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round-bottomed polypropylene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Roche Diagnostics Australia</td>
			<td>10835242001</td>
			<td>Stock solution prepared at 100 &#956;g/mL in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep kit</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>K2100-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME transfection buffer</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP (Phosphatase inhibitor)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek Gmbh</td>
			<td>gta-100</td>
			<td>GFP nanobody coupled to agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-terminal GFP monoclonal antibody&#160;</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-118P</td>
			<td>Will detect the V1 tag within the BiFC vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-terminal GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>Will detect the V2 tag within the BiFC vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Supplemented with 1 mL &#946;-mercaptoethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>V5117h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Point of Care Diagnostics</td>
			<td>0030 108 116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td>Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10628494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-386-2</td>
			<td>To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Stage Tips, 10 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSBA117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.9 &#956;m C18 ReproSil particles</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r119.aq.</td>
			<td>Stationary phase particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-nLC HPLC&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Non-ionic detergent (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Heat-shock-competent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting multi-protein signaling complexes by bimolecular complementation affinity purification (bicap)

Die Montage von Proteinkomplexen ist ein zentraler Mechanismus zugrunde liegt die Regulierung der vielen Zelle Signalwege. Ein wichtiger Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung ist entziffern, wie diese dynamische Proteinkomplexe handeln, um Signale aus mehreren Quellen um eine spezifische biologische Reaktion direkt zu integrieren, und wie dies in vielen Krankheit Einstellungen dereguliert wird. Trotz der Bedeutung dieses wichtigen biochemischen Mechanismus gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken, die die spezifisch und sensitiv Dekonvolution dieser Multi-Molekulare Signalisierung komplexe erleichtern können.
Hier richtet sich dieses Manko durch die Kombination eines Protein-Ergänzung-Assays mit einer Konformation-spezifische gemeinnützige, die wir Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP) bezeichnet haben. Diese neuartige Technik ermöglicht die spezielle Isolierung und nachgelagerten Proteomic Charakterisierung jedes Paar von interagierenden Proteine, unter Ausschluss des un-komplexiert einzelne Proteine und komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.
BiCAP-Technik ist anpassungsfähig an eine breite Palette von nachgelagerten experimentelle Tests und der hohe Grad an Spezifität bot durch diese Technik ermöglicht mehr differenzierte Untersuchungen in die Mechanik der Protein komplexen Baugruppe als derzeit möglich ist mit Standard-Affinität Reinigungstechniken.

Nach dem Einsatz von Rekombination Klonen zum Generieren von V1 und V2 tagged Gene of Interest mit BiFC pDEST Plasmide, Co-Transfektion von zwei Plasmide mit Pair interagierenden Proteine führt bei der Erzeugung von ein Fluoreszenzsignal Venus nach ca. 8-24 Stunden. Bei fehlender ein positives Signal ist es möglich, dass die Protein-Interaktion durch die Wahl der Zelllinie nicht auftreten kann, ist eine niedrige Transfection Leistungsfähigkeit oder dass die Ausrichtung der BiFC Tags ni...

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Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...