Name: dissecting multi-protein signaling complexes by bimolecular complementation affinity purification (bicap)
Uploaded: 2018-06-15T13:30:00
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D.R.C é um companheiro de NSW do Instituto de câncer e D.N.S anteriormente foi um companheiro de NSW do Instituto de câncer. Os findings da pesquisa apresentados neste manuscrito foram financiados pelo câncer Instituto NSW (13/FRL/1-02 e 09/CDF/2-39), NHMRC (projeto Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/GRIC/B2157), NSW escritório de ciência e pesquisa médica, a família de comentários Comunhão e família Mostyn Foundation. J.F.H. e R.S. foram os destinatários de um prêmio de pós-graduação australiana.

1. plasmídeo de clonagem
Nota: Para gerar vetores do plasmídeo com as tags V1 ou V2 fundidas à extremidade N-terminal ou do C-terminal do gene de interesse, BiFC vetores de destino tenham sido depositados com Addgene [marca N-terminal: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal marca: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. O gene/s de interesse será necessário em específica recombinação clonagem vetores de entrada compatível (ou seja, pDONR223 ou pENTR221)...

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	<li>Kolch, W., Pitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+proteomics+to+dissect+tyrosine+kinase+signalling+pathways+in+cancer.">Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).</li><li>Pawson, T., Kofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome+signaling+through+regulated+protein-protein+interactions+in+normal+and+cancer+cells.">Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).</li><li>Croucher, D. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, 15690 (2017).</li></ol>

BiCAP é um poderoso método para isolar dímeros de proteína específica excluindo os componentes individuais e seus concorrentes de parceiros de ligação3. BiCAP baseia-se na adaptação de um ensaio de complementação da fluorescência da proteína chamada BiFC6. Os métodos existentes, incluindo ensaios de ligadura BiFC e proximidade, têm sido amplamente utilizados para visualizar e quantificar as interações da proteína em células vivas7,...

Montagem complexa de proteínas é um processo chave na manutenção da especificidade spatiotemporal de muitas vias sinalização1,2. Enquanto a natureza crítica desse papel regulador é amplamente reconhecida, há uma falta de técnicas experimentais disponíveis para escrutinar esses complexos. A maioria dos estudos interactomics focar nas interações com proteínas individuais, ou o enriquecimento sequencial de componentes complexos individuais. Aqui apresentamos uma técnica para o isolamento de um dímero de proteínas específicas, enquanto excluir as partes individuais de proteínas componente os complexos formados com vinculação parceiros3a competir. Chamamos esta técnica Bimolecular complementação de purificação da afinidade (BiCAP), que é uma combinação de um previamente existentes ensaio de complementação fragmento da proteína, complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC), com o novo uso de um nanobody recombinante de conformação específica para as boas práticas agrícolas e seus derivados (ver tabela de materiais).
Um ensaio de complementação do proteína-fragmento típica baseia-se na expressão de proteínas de "isca" e "presas" fundidos para separar fragmentos de repórteres como luciferase4, β-galactosidase5ou proteína verde fluorescente (GFP)6 ( Figura 1A). Através da interação das proteínas presas e isca, os domínios de repórter de divisão são encorajados a redobrar-se em uma estrutura funcional, permitindo a interação da isca e atacam proteínas para ser visualizado ou quantificada. BiCAP foi adaptado de uma versão dessa técnica que fez uso de fragmentos da variante GFP Venus. Ensaios de complementação de proteínas fluorescentes são um método popular para poder visualizar as interações da proteína-proteína em uma célula viva, mas até agora têm sido limitados a esta um função7. BiCAP representa um avanço significativo a este respeito, como esta técnica não só permite a visualização, mas também o isolamento e interrogatório da interação da proteína-proteína resultante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig1.jpg"> Figura 1: O estrutural principal por trás da técnica BiCAP. (A) um esquema descrevendo o diretor por trás mostrando de complementação de fluorescência bimolecular as proteínas 'isca' e 'presas' marcado com o N-terminal V1 ou V2 C-terminal fragmentos da proteína completo Venus. (B) análise estrutural da interface de interação (ciano) entre o GFP nanobody (verde) e recombinada Vênus, mostrando a posição do (cinza) V1 e V2 (laranja) fragmentos (PDB 3OGO de adesão). Esta figura é republicado fromCroucher et al3 reproduzido com permissão da AAAS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O BiCAP técnica faz uso de dois fragmentos de não-fluorescente de Vênus (chamado V1 e V2) que associam com baixo grau de afinidade, a menos que uma interação ocorre entre seus parceiros de fusão. Neste caso, os divisão de dois domínios redobrar na estrutura funcional do β-tambor do fluoróforo (figura 1B)6. A inovação chave de BiCAP vem desde a introdução do nanobody recombinante de GFP, que reconhece um epítopo tridimensional sobre o β-barril de GFP (e variantes como Venus), que só está presente no fluoróforo corretamente recombinado e dobrado ( Figura 1B)8. Crucialmente, a GFP nanobody não liga para qualquer um dos fragmentos individuais Venus. Isso facilita o isolamento de dímeros de proteína somente depois que as duas proteínas formaram um complexo de vontade própria, levando a resultados mais representativos do que as adquiridas de métodos que fazem usam de interações quimicamente induzida, forçada9.
BiCAP é uma técnica poderosa que incide especificamente sobre proteínas multi complexos, que potencialmente podem ser combinados com um número de aplicações a jusante para melhorar a granularidade da nossa compreensão do papel que destes complexos jogar na transdução de sinal . Também abrange a característica importante de permitir a visualização de proteína interações in situ. Até à data, foi demonstrado como um método eficaz de analisar a interactome de receptores tirosina quinase (RTK) dímeros3BiCAP, mas a capacidade de adaptação desse método significa que pode ser adotado em quase qualquer contexto de interação de proteínas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL round-bottomed polypropylene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Roche Diagnostics Australia</td>
			<td>10835242001</td>
			<td>Stock solution prepared at 100 &#956;g/mL in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep kit</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>K2100-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Australia</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME transfection buffer</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME transfection reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP (Phosphatase inhibitor)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek Gmbh</td>
			<td>gta-100</td>
			<td>GFP nanobody coupled to agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-terminal GFP monoclonal antibody&#160;</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-118P</td>
			<td>Will detect the V1 tag within the BiFC vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-terminal GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>Will detect the V2 tag within the BiFC vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>Supplemented with 1 mL &#946;-mercaptoethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>V5117h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Point of Care Diagnostics</td>
			<td>0030 108 116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td>Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10628494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-386-2</td>
			<td>To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Stage Tips, 10 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSBA117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.9 &#956;m C18 ReproSil particles</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r119.aq.</td>
			<td>Stationary phase particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-nLC HPLC&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Non-ionic detergent (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Heat-shock-competent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting multi-protein signaling complexes by bimolecular complementation affinity purification (bicap)

A montagem de complexos de proteínas é um mecanismo central subjacente a regulação da célula muitas vias de sinalização. Um grande foco de investigação biomédica é decifrar como estes complexos de proteína dinâmica agem para integrar sinais de várias fontes a fim de direcionar uma resposta biológica específica, e como isto se torna desregulamentado em muitas configurações de doença. Apesar da importância deste mecanismo bioquímico chave, há uma falta de técnicas experimentais que podem facilitar a deconvolução destes complexos de sinalização multi molecular específica e sensível.
Aqui esta lacuna é abordada através da combinação de um ensaio de complementação da proteína com um nanobody de conformação específica, que nós temos denominado Bimolecular complementação de purificação da afinidade (BiCAP). Esta nova técnica facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de qualquer par de interação de proteínas, com exclusão das proteínas individuais das Nações Unidas-complexado e complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.
A técnica de BiCAP é adaptável a uma ampla gama de ensaios experimentais a jusante, e o alto grau de especificidade, proporcionada por esta técnica permite mais matizadas investigações sobre a mecânica da montagem complexa de proteína do que é actualmente possível usando técnicas de purificação de afinidade padrão.

Após o uso de recombinação clonagem para gerar de V1 e V2 tagged genes de interesse com o plasmídeo de pDEST BiFC, co transfeccao de dois plasmídeos, que contém um par de proteínas interagindo resultará na geração de um sinal fluorescente Venus após cerca de 8 a 24 horas. Na ausência de um sinal positivo, é possível que a interação da proteína pode não ocorrer devido à escolha da linha celular, uma eficiência de transfeccao baixa ou que a orientação das marcas BiFC n...

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Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

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Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

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Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

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Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

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Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

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Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...